黃酒中生物胺對小鼠胺類氧化酶和免疫功能的影響

周瑋忻，伍梓汐，萬 群，程如越，沈 曦，李 鳴，張 明，陳歷水，劉 蕾，何 方*

（1.四川大學 華西公共衛生學院，四川 成都 610041；2.北京工商大學 食品學院，北京 100048；3.中糧營養健康研究院 食品研發中心，北京 100020）

黃酒是我國特有的低度飲料酒，距今已有5 000多年的歷史，與啤酒、葡萄酒統稱為世界三大釀造酒。黃酒中有豐富的氨基酸、多酚和低聚糖等活性物質，能增強機體免疫力、抗氧化、保護心血管等，但大量的氨基酸可能導致發酵過程微生物作用而產生生物胺（biogenic amine，BA）[1-2]。

生物胺是一類含氮堿性化合物，黃酒中的生物胺主要包括酪胺、組胺、腐胺、尸胺、β-苯乙胺、色胺、精胺等[3]。少量生物胺具有一定的生理功能，但機體攝入高生物胺含量的食品或不充分代謝會導致生物胺積累，引起血壓升高、頭痛、心悸等毒性作用[4-5]。發酵食品中的生物胺主要由某些微生物產生的氨基酸脫羧酶而成，正常情況下，哺乳動物腸道內有單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶等代謝生物胺的解毒酶系統，但遺傳導致胺類氧化酶缺乏或外界因素引起胺類氧化酶活性降低，均會增加人體對生物胺的敏感性。有研究稱低于10%的乙醇含量可以增加脫羧酶的活性，而12%的乙醇還會抑制91%的胺類氧化酶活性[6-8]，同時乙醇還會增大小腸壁吸收生物胺的通透性，所以酒精飲料中更應注重生物胺的含量及其毒性作用。黃酒中生物胺含量遠高于葡萄酒和啤酒[9-10]，雖然有很多關于黃酒中生物胺含量的測定研究，但由于不同生物胺有不同的毒性以及它們之間的相加和協同作用、機體解毒酶活性、個體差異等，生物胺的毒性閾值很難確定[11]，目前還沒有國家出臺黃酒中生物胺的限量標準。

隨著生活水平的提高和消費者自我保護意識的增強，人們對食品安全的要求越來越高。通過對受試小鼠單胺氧化酶、二胺氧化酶活性的測定和免疫因子的檢測，對黃酒及生物胺的安全性進行探討，初步評估黃酒及其生物胺對機體產生的影響，為規范黃酒生產工藝和生物胺含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

黃酒由北京中糧集團有限公司提供，酒精度為19.55%vol，總生物胺含量為106.24 mg/L，最高的三種分別是腐胺45.62 mg/L、色胺33.81 mg/L、酪胺15.79 mg/L，-4℃保存。

1.1.2 實驗動物

無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級雄性昆明種小鼠，60只，4周齡（體質量18～20 g），購于四川省醫學科學院/四川省人民醫院實驗動物研究所［許可證號：SCXK（川）2013-15］。昆明小鼠于本校動物實驗中心適應性喂養一周，標準環境喂養，自由飲水和攝食。

1.1.3 主要試劑

腐胺、色胺、酪胺標準品：美國Sigma公司；單胺氧化酶、二胺氧化酶、蛋白定量測試盒均來自南京建成生物工程研究所；免疫因子檢測試劑盒：R&D公司Luminex Assay系列（96孔）。

1.2 儀器與設備

Chemray 240全自動生化分析儀：深圳雷杜生命科技有限公司；752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；VCX 130超聲波細胞破碎儀：SONICS公司；CX31光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Luminex LX-200分析儀：R&D公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥方法

實驗動物隨機分為3個對照組（空白對照組、酒精對照組、BA對照組）和3個實驗組（黃酒組、黃酒+9倍BA組、黃酒+99倍BA組），每組10只。每日每只的灌胃量如下：

空白對照組灌胃0.2 mL生理鹽水；酒精對照組的灌胃量根據中國居民膳食營養素參考攝入量（2016版）中成人（60 kg）每日最高可攝入的酒精量（30 g）換算，以0.5 mg/g小鼠體質量（以下表示為mg/g）的酒精進行灌胃；黃酒組與酒精對照組具有相同的酒精灌胃量，以2.56 mg/g的黃酒進行灌胃；BA對照組與黃酒組具有相同的腐胺、色胺、酪胺灌胃量，以腐胺1.23×10-4mg/g+色胺8.86×10-5mg/g+酪胺4.29×10-5mg/g進行灌胃；黃酒+9倍BA組是以9倍BA對照組的生物胺劑量添加到與黃酒組同劑量的黃酒中；黃酒+99倍BA組是以99倍BA對照組的生物胺劑量添加到與黃酒組同劑量的黃酒中。

小鼠每周稱質量一次，根據體質量變化每周更換一次灌胃試劑量，以水為溶劑，保證灌胃量均為0.2 mL/（只·d），連續灌胃30 d。

1.3.2 取材及檢測

受試小鼠于第30天灌胃后，禁食不禁水。12h后用眼球摘除法取血，置于離心管，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心10 min分離血清，取上清液，再以3 000 r/min，1 min進行二次離心，收集上清液于-80℃冰箱保存備用。小鼠脫頸處死后，迅速解剖腹部和頭部，取肝大葉中心部位，用生理鹽水沖洗，放入4%中性多聚甲醛固定24 h，制作石蠟切片，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察；同時將大腦、小腸和剩下的肝臟凍存于-80℃冰箱待檢。

根據二胺氧化酶測試盒的說明書進行操作，用全自動生化分析儀檢測血清和小腸組織中DAO活性；參照蛋白定量測試盒和單胺氧化酶測試盒的說明書操作，用紫外可見分光光度計檢測肝臟和大腦中MAO活性。參照Luminex Assay免疫因子測試盒操作，用LuminexLX-200分析儀測定血清的白細胞介素（interleukin，IL）-12、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和干擾素（interferon，IFN）-γ。

1.3.3 數據處理與分析

采用SPSS 22.0對數據進行統計分析，對于符合方差分析條件的數據，結果用xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用SNK法或LSD法）；對于分布不明的數據，結果用中位數（四分位數間距）表示，多組間比較采用非參數檢驗Kruskal-Wallis單因素方差分析。當P＜0.05時，差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠的胺類氧化酶活性

2.1.1 小鼠大腦、肝臟MAO活性

正常情況下，單胺氧化酶是一類黃素蛋白，主要分布于肝、腦等器官的線粒體中，能夠選擇性催化生物胺和神經遞質的代謝[12]。MAO在腦神經組織中積累過多，就會產生過量的胺代謝產物，而這些產物被認為是引起各類精神疾病的重要原因[13]。早有報道[14-15]指出，MAO可作用于中樞系統和神經末梢組織，其活性異常可能與帕金森氏病、抑郁、阿爾茨海莫氏癥等疾病相關，所以MAO活性可反映機體生理狀態。各組小鼠大腦和肝臟MAO活性的測定結果見表1。

表1 各組小鼠大腦和肝臟單胺氧化酶活性的測定結果Table 1 Determination results of monoamine oxidase activities of brain and liver in the tested mice U/mg

由表1可知，酒精對照組和BA對照組的大腦MAO活性均高于空白對照組（P＜0.05），黃酒+9倍BA組和黃酒+99倍BA組大腦MAO活性均高于黃酒對照組（P＜0.05），而黃酒對照組與空白對照組大腦MAO活性的差異無統計學意義（P＞0.05）；黃酒對照組大腦MAO活性低于酒精對照組（P＜0.05），而黃酒+9倍BA組和黃酒+99倍BA組與酒精對照組的大腦MAO活性差異無統計學意義（P＞0.05），推測酒精和生物胺單獨作用均引起大腦MAO升高，黃酒可能對低劑量生物胺和酒精引起的大腦MAO活性升高具有一定的保護作用，當黃酒中生物胺含量達到10倍和100倍時，能明顯引起大腦MAO活性的升高，同時指出黃酒的保護作用隨生物胺含量不同是有限度的。BA對照組的肝臟MAO活性低于空白對照組（P＜0.05），而3個實驗組與空白對照組的肝臟MAO活性差異無統計學意義（P＞0.05）。提示生物胺單獨作用能引起肝臟MAO活性略微降低，但與黃酒共同作用時（100倍劑量為止），未引起肝臟MAO活性的明顯變化。大腦、肝臟的測定結果說明適量飲用該黃酒不會引起機體MAO活性明顯的變化，同時本次實驗中酒精未表現出抑制肝臟MAO活性，可能是因為實驗投用酒精量較少，尚不足以引起MAO活性改變。

2.1.2 小鼠血清、小腸DAO活性

DAO在體內主要分布于小腸粘膜，血清中含量極少，主要作用于外源性或內源性組胺的氧化脫氫[16]。當小腸粘膜受到損傷或屏障功能衰退時，胞內釋放DAO增加，進入血液、腸間隙等，引起血清DAO升高；其次，壞死腸粘膜細胞會脫落從而引起小腸粘膜組織DAO下降[17-18]，故小腸和血清DAO活性可反映小腸粘膜完整性和功能性。各組小鼠血清和小腸DAO活性的測定結果見表2。

表2 各組小鼠血清和小腸二胺氧化酶活性的測定結果Table 2 Determination results of diamine oxidase activities of blood serum and small intestine in the tested mice U/L

由表2可知，與空白對照組相比，本實驗中各組間受試小鼠的小腸組織和血清DAO活性的差異無統計學意義（P＞0.05）。說明黃酒中的生物胺（100倍劑量為止）未對受試小鼠腸粘膜造成嚴重的刺激。

2.2 小鼠的肝臟病理形態

病理形態觀察是動物實驗中為了觀察組織是否病變的一種常用手段，有研究表明[19-20]，長期過量飲酒對多種器官，特別是肝臟有直接的毒性作用，其主要機制是氧化應激和炎癥。不同處理組的小鼠肝臟病理形態觀察結果見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟病理形態Fig.1 Pathomorphology of liver of the tested mice

光鏡下觀察可見，空白對照組小鼠肝細胞核大而圓，胞質均勻，細胞間聯系緊密；肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列；匯管區無炎性細胞浸潤；未見細胞變性、腫脹；肝竇和肝細胞均未見異常。其他各組小鼠肝細胞、肝細胞索、肝竇、中央靜脈、匯管區的細胞形態正常，排列整齊，和對照組比未見明顯異常病理改變。提示生物胺或者黃酒的干預未對小鼠肝臟造成明顯的傷害，這與以往酒精損傷肝臟的研究不同，可能原因有：一是酒精對照組的酒精投用劑量是按照膳食營養素參考攝入量（dietaryreference intakes，DRIs）中健康推薦量計算的，含量在安全范圍內；二是研究對象原料不同，前者研究的是純酒精，而實驗組用的黃酒，黃酒含有酚類、谷胱甘肽等活性成分，具有抗氧化作用[21]，能減緩酒精對肝臟的損害；三是可能與實驗周期有關。

2.3 小鼠的免疫因子水平

免疫系統細胞的增殖、分化和功能受到一系列細胞因子的調節。根據功能細胞因子可分為白細胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子等，它們通過合成、分泌及基因表達來相互作用、相互影響，從而發揮免疫功能[22]。各組小鼠血清白細胞介素的測定結果和TNF-α、IFN-γ的測定結果分別見表3和表4。

表3 各組小鼠血清白細胞介素的測定結果Table 3 Determination results of serum interleukin level in the tested mice

表4 各組小鼠TNF-α、IFN-γ的測定結果Table 4 Determination results of TNF-α and IFN-γ levels in the tested mice pg/mL

由表3、表4可知，實驗中黃酒+外源性生物胺（100倍劑量為止）未對除IL-1β外的其他免疫因子指標造成明顯影響。IL-1在機體炎癥、感染、損傷及免疫調節等方面扮演重要角色，主要包括IL-1α和IL-1β兩種形式，IL-1α是炎癥發生的始動因子，而IL-1β作為其主要活動形式則主導炎癥反應的傳播，維持正常內環境穩態[23]。BA對照組IL-1β含量低于空白對照組（P＜0.05），黃酒+99倍BA組IL-1β含量比空白對照組、酒精對照組和黃酒+9倍生物胺組低（P＜0.05），而黃酒組IL-1β含量與空白對照組、酒精對照組的差異無統計學意義（P＞0.05），推測生物胺單獨作用能引起小鼠血清IL-1β含量失調，引起機體免疫系統功能紊亂，而當外源性生物胺與黃酒共同作用時，生物胺劑量達到100倍時才會引起IL-1β含量明顯變化。

3 結論

本次實驗發現，外源性生物胺會引起大腦MAO活性升高、肝臟MAO活性下降、IL-1β水平失調，指出外源性生物胺可能具有影響機體生理及免疫系統功能的風險。但是當外源性生物胺與黃酒共同作用時，這些情況會有所變化。當黃酒中的生物胺濃度達到10倍劑量，就可以引起大腦MAO活性升高，當黃酒中的生物胺濃度達到100倍劑量，才出現明顯的IL-1β水平失調，但肝臟MAO活性無明顯變化，結果表明黃酒可能具有對生物胺保護作用。限量飲用該黃酒不會引起大腦、肝臟MAO活性和血液、小腸組織DAO活性的變化和免疫功能失調，同時肝臟的病理形態結果也輔助證明了其安全性。雖然該黃酒在限量范圍內未表現出毒性作用，但生物胺含量的多少會影響黃酒對機體的健康，所以如何降低生物胺含量仍是未來黃酒發酵工藝需要克服的一大難點。