幾丁質脫乙酰酶高產菌株的選育及其發(fā)酵特性研究

魏麗蓉，秦汪艷，李永成*

（海南大學 食品學院，海南 海口 570228）

幾丁質（chitin）是一種由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖胺通過β-1,4糖苷鍵聚合而成的高聚物，是地球上含量僅次于纖維素的可再生天然多糖[1]，它主要存在于海洋無脊椎動物的甲殼和骨組織以及真菌和植物的細胞壁中，在蝦、蟹等水產品加工廢棄物中尤為豐富。幾丁質化學結構穩(wěn)定，其弱降解性和低溶解性嚴重制約了它在各行各業(yè)的的應用[2]。殼聚糖（chitosan）是幾丁質脫去乙酰基后形成的一種低分子衍生物，因其含有大量游離氨基和堿性陽離子而比幾丁質具有更好的溶解性[3]和生物可降解性[4]。此外，殼聚糖具有抗菌性、吸附性和低膽固醇等優(yōu)良特性，在食品、醫(yī)藥、輕紡、印染、環(huán)保和農業(yè)等領域應用廣泛[5]。

目前，殼聚糖的制備主要通過濃堿熱解脫去幾丁質的乙酰基，該法存在嚴重的環(huán)境污染問題，且脫乙酰的過程難以控制，使殼聚糖產品的脫乙酰程度不一致，導致產品品質均一性差[6]。幾丁質脫乙酰酶（chitindeacetylase，CDA）可水解脫去幾丁質的乙酰基，是一種新型的酶法生產殼聚糖的方法，其反應條件溫和，環(huán)保以及催化過程的可控性逐漸受到重視。該酶最初是由ATAKI Y等[7]從接合菌綱（Zygomycetes）的毛霉屬真菌（Mucorrouxii）中發(fā)現(xiàn)，此后研究者又從細菌、昆蟲甚至放線菌也發(fā)現(xiàn)了這種酶。DAI DH等[8]研究了培養(yǎng)基的組成成分和初始pH對類芽抱桿菌屬（Bacillusspp.）菌株Hul產CDA情況的影響，優(yōu)化后的酶活力為0.6 U/mL。ZHANG H等[9]運用Plackett-Burman（P-B）設計對一株產幾丁質酶的日本根霉菌M193的產酶條件進行優(yōu)化，使得酶活力提升為0.55 U/mL。研究表明目前野生菌株CDA的產量仍然處于很低的水平。KAFETZOPOULOS D等[10]克隆M.rouxii、C.lindemuthianum來源的CDA基因并分別在大腸桿菌（Escherichia coli）和巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）中成功表達。KADOKURAK等[11]克隆副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）KN1699來源的CDA編碼區(qū)及信號肽ORF，在E.coli宿主細胞中異源表達，獲得高濃度的CDA產物。KANGL等[12]將Collettotrichumlindermuthianum來源的CDA基因與pHBM905A克隆載體連接后，導入Pichia pastoris中表達，獲得的CDA酶活力達到77.27 U/mg。雖然基因工程目的性強，可獲得高產CDA誘變菌株，但其工作量大，技術難度較高。而誘變育種是通過人工誘變的方法使微生物發(fā)生基因突變，通過篩選獲得產量高、性能優(yōu)良的突變體。這種方法簡便易行，且變異體穩(wěn)定性好，能較好地提高代謝產物產量[13]。因此，本研究以實驗室保存的一株海洋絲狀真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S為出發(fā)菌株，通過多級紫外誘變獲得一株高產CDA的菌株，并對其發(fā)酵特性和CDA脫乙酰度（deacetylation degree，DD）機制進行研究，以期為酶法制備殼聚糖提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

海洋絲狀真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S：本實驗室從中國海口東寨港紅樹林土壤中篩選獲得。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂等（均為分析純）：廣州化學試劑廠；幾丁質（生化試劑）：上海源葉生物科技有限公司；對硝基乙酰苯胺（純度＞99.0%）：上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，氯化鈉1.0%。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.25%，酵母浸膏0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸銨0.4%，氯化鈉1%，初始pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0.4%，酵母浸膏0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，氯化鈉1%，膠體幾丁質0.1%，初始pH 6.0。

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖0.25%，酵母浸膏0.5%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.8%，磷酸二氫鉀0.03%，磷酸氫二鉀0.7%，膠體幾丁質0.1%，對硝基乙酰苯胺0.2%，瓊脂2%，初始pH6.0。

所有培養(yǎng)基在121℃條件下高壓蒸汽滅菌16 min。

膠體幾丁質：將2g幾丁質粉末加入至40 mL濃鹽酸中，攪拌至其完全溶解，然后加入200 mL提前預冷的體積分數(shù)為50%的乙醇水溶液，攪拌2 h，4℃靜置過夜。8 000 r/min離心20 min，收集沉淀，采用去離子水反復洗滌至膠體幾丁質呈中性。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養(yǎng)箱：韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；HZQ-X300搖床：上海一恒科學儀器公司；LGJ-12A冷凍干燥機：軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠；YXQ-LS高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用有限公司；TENSOR27傅立葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IRDUI）儀：德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

菌株活化：菌株于斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～6 d，待產孢后，用5 mL 0.9%生理鹽水刮下孢子，調整孢子懸浮液濃度為1×107CFU/mL。將上述孢子懸液轉接到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)36 h。

種子液的制備：將上述孢子懸液轉接到裝有50mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。

搖瓶發(fā)酵：種子液按2%（V/V）的接種量接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min培養(yǎng)72 h。

1.3.2 多級紫外線誘變

斜面中加入10 mL 0.9%的無菌生理鹽水，刮下孢子制成孢子懸浮液，并將其濃度調整為1×108CFU/mL。取8 mL孢子懸浮液于無菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下照射處理（30W，平皿垂直上方30 cm處）。在150～300 s的時間范圍內，每30 s取出0.1 mL上述紫外線處理液，涂布于篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d。根據菌落周圍黃色透明圈直徑大小篩選出正突變體菌株[14]。選取CDA酶活較高的菌株按上述方法進行二次紫外誘變處理，篩選獲得CDA酶活最高的菌株。

1.3.3 CDA粗酶液的制備

發(fā)酵液于4℃條件下抽濾，濾液即為胞外粗酶液。在抽濾所得的菌絲體中加入預冷的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.0）和石英砂，在低溫條件下快速碾磨，漿液立即在4℃、6 000 r/min離心20 min，所得上清液即為胞內粗酶液。

1.3.4 發(fā)酵特性試驗

發(fā)酵特性曲線的測定：按2%（V/V）的接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次，測定菌絲體干質量、殘?zhí)橇考癈DA酶活力，考察最優(yōu)突變株的發(fā)酵特性。

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，接種量為2%（V/V）、裝液量為50mL/250mL，考察不同初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、濃度為11 mmol/L[15]的無機鹽種類（MgSO4、FeCl3、CaCl2、BaCl2、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、NaH2PO4、KH2PO4）、膠體幾丁質添加量（0、0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%）對最優(yōu)突變菌株產CDA的影響。

1.3.5 細胞壁幾丁質的制備

發(fā)酵液過濾后獲得菌絲體，去離子水反復洗滌菌絲體至上清液無殘留葡萄糖。將菌絲體浸沒于0.5 mol/L NaOH料液比1∶40（g∶mL），經400 W超聲30 min，除去菌絲體的蛋白質。破碎的細胞壁依次經過0.1 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、二甲基亞砜、體積分數(shù)為95%的乙醇水溶液料液比1∶40（g∶mL）進行脫鈣處理，細胞壁幾丁質經去離子水反復洗滌至中性后，冷凍干燥至質量恒定[16]。

1.3.6 測定方法

（1）CDA酶活力的測定：參照文獻[17]。

（2）殘?zhí)橇康臏y定：采用二硝基水楊酸法（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[18]測定還原糖的含量。

（3）菌絲體干質量的測定：將發(fā)酵液真空抽濾后，收集菌絲體，菌絲體用蒸餾水反復洗滌后，60℃烘干至恒質量，測其干質量。

（4）細胞壁幾丁質脫乙酰度的測定：采用傅里葉變換紅外光譜測定細胞壁幾丁質的脫乙酰度[19]。取2 mg干燥后的樣品與150 mg溴化鉀充分研細后，用壓片機壓片。以相同質量的溴化鉀壓片為對照，掃描波數(shù)為500～4000cm-1的透光率。幾丁質的脫乙酰度（DD）計算公式為[20]：

式中：A1560、A2880分別為波數(shù)1 560 cm-1和2 890～2 925 cm-1的峰面積；0.813為A1560/A2880線性系數(shù)；1.152：不同脫乙酰度幾丁質紅外掃描后A1560/A2880所作曲線的k值。

2 結果與分析

2.1 多級紫外線誘變

挑取經兩次誘變處理后的正突變菌株UV-1S、UV-2S、UV-3S、UV-4S、UV-5S、UV-6S、UV-7S，接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5～6d，隨后將這些菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，180r/min搖床培養(yǎng)72h。以出發(fā)菌株Penicilliumjanthinellum UV-0S為對照，測定正突變菌株胞內和胞外的CDA酶活力，正突變菌株的CDA酶活力測定結果見表1。由表1可知，UV-3S菌株的胞外CDA酶活力最高，為（11.05±0.18）U/mL，是原始菌株UV-0S的2.1倍，將突變菌株UV-3S經過6次傳代測定其產酶穩(wěn)定性，結果顯示突變株UV-3S每一代均可穩(wěn)定產酶，酶活穩(wěn)定在10.87～11.25 U/mL，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性[21]。

表1 正突變菌株胞內、胞外CDA酶活力比較Table 1 Comparison of extracellular and intracellular CDA activities of positive mutant strains

2.2 發(fā)酵特性曲線

菌株UV-0S和突變菌株UV-3S的發(fā)酵特性曲線見圖1。由圖1可知，菌株UV-0S和UV-3S的胞內CDA酶活力遠遠低于胞外CDA活性，因此后續(xù)的研究以胞外CDA計。在0～72 h的生長期內，CDA酶活力增加，發(fā)酵72 h后開始下降。UV-0S和UV-3S的生長曲線符合微生物典型的“J”型生長曲線：對數(shù)期（24～48 h），真菌生長導致葡萄糖的快速消耗；緩慢生長期（48～72 h），此階段碳源的消耗速率相對較慢；自噬階段（84 h之后）。從菌絲生長和CDA合成的過程曲線可知胞外CDA的分泌與菌絲生長呈現(xiàn)耦合關系[22]。

圖1 Penicillium janthinellumUV-0S（A）和突變株UV-3S（B）的發(fā)酵特性曲線Fig.1 Fermentation characteristic curve ofPenicillium janthinellum UV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)

2.3 初始pH值對突變株UV-3S產CDA的影響

培養(yǎng)基的pH會影響細胞膜所帶電荷，從而影響細胞與外界物質交換的速率，因此確定最適的pH對產酶具有重要意義[23]。初始pH值對菌株Penicillium janthinellumUV-0S和突變株UV-3S產CDA和生物量的影響結果見圖2，由圖2可知，初始pH值為9.0時，CDA活性最高，菌株UV-0S的CDA酶活為6.50U/mL，突變株UV-3S的CDA酶活為16.76U/mL，分析原因可能是酸堿度通過影響CDA合成過程中相關酶及其他相關活性物質的穩(wěn)定性和生物活性來影響胞外CDA的合成與分泌[24-25]。但此時的細胞生物量最低，表明生物量并不是影響CDA活力的唯一因素。

圖2 初始pH值對Penicillium janthinellumUV-0S(A)和突變株UV-3S(B)產CDA和干質量的影響Fig.2 Effect of initial pH value on CDA production and dry mass of Penicillium janthinellumUV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)

2.4 無機鹽種類對突變株UV-3S產CDA的影響

圖3 無機鹽對Penicillium janthinellumUV-0S(A)和突變株UV-3S(B)產CDA和干質量的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on CDA production and dry mass of Penicillium janthinellumUV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)

無機鹽為微生物生長提供各種重要元素，可作為細胞組分、生理調節(jié)物質、酶的激活劑等參與微生物的整個生長代謝過程[26]。不同無機鹽對突變株UV-3S產CDA的影響結果如圖3所示。由圖3可知，添加11 mmol/L NaH2PO4無機鹽時，出發(fā)菌株UV-0S和突變株UV-3S的CDA酶活力最高，分別5.718 U/mL和10.53 U/mL，分析其原因可能是，Na+對CDA酶有一定的激活作用，或作為該酶的組成部分，對維持酶的活性結構具有重要意義[27]。

2.5 膠體幾丁質對突變株UV-3S產CDA的影響

誘導劑是影響酶生物合成的重要因素，CDA是種誘導酶，其合成需要底物幾丁質作為誘導物。然而一般的幾丁質原料無法溶解于培養(yǎng)基中，使得菌株不能直接利用幾丁質[28]。因此，試驗將幾丁質配制成膠體幾丁質使用，探究膠體幾丁質對菌株產酶的影響。膠體幾丁質對CDA酶活力的影響結果如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基中膠體幾丁質添加量為0.2%時，出發(fā)菌株UV-0S的CDA酶活達到最大值，為4.42 U/mL。膠體幾丁質添加量為0.5%時，UV-3S的CDA酶活力最高，為11.83 U/mL。未添加膠體幾丁質時，胞外CDA酶活處于較低水平，添加膠體幾丁質后，CDA酶活驟然上升，說明膠體幾丁質作為CDA酶合成的底物，對CDA合成有誘導作用。

圖4 膠體幾丁質的添加量對Penicillium janthinellumUV-0S和突變株UV-3S產CDA和干質量的影響Fig.4 Effect of colloidal chitin addition on the CDA production and dry mass ofPenicillium janthinellumUV-0S and mutant strain UV-3S

2.6 細胞壁幾丁質脫乙酰度的變化

波數(shù)3 480 cm-1、2 840～2 962 cm-1分別為-OH和-CH伸縮振動吸收峰[29]，波數(shù)1656 cm-1、1 560 cm-1和1 315 cm-1分別為酰胺I、II、III伸縮振動吸收峰。酰胺吸收峰的變化證實了N-脫乙酰的發(fā)生，峰面積越小，N-脫乙酰度越高[30]。Penicillium janthinellumUV-0S和突變株UV-3S不同生長時間細胞壁幾丁質紅外光譜研究結果見圖5。由圖5可知，出發(fā)菌株UV-0S的幾丁質1（42 h）、幾丁質2（72 h）、幾丁質3（96 h）的DD值分別為80.05%、84.01%、90.52%。突變菌株UV-3S的幾丁質a（42 h）、幾丁質b（72 h）和幾丁質c（96 h）的DD值分別為74.04%、76.33%、79.62%。出發(fā)菌株UV-0S和突變株UV-3S細胞壁幾丁質的DD值隨真菌的生長而增加，96 h時DD值最高。此外，出發(fā)菌株UV-0S的細胞壁幾丁質較突變菌株UV-3S表現(xiàn)出更高的脫乙酰基化程度。幾丁質是真菌細胞壁的重要組成部分，細胞壁的生長與CDA有著密切的聯(lián)系，CDA在真菌發(fā)育的所有生命階段都參與了幾丁質多糖的N-脫乙酰化，提高了殼聚糖在細胞壁中的比例，這可能對真菌防御惡化環(huán)境或輔助自我防御有積極作用[31]。

圖5 Penicillium janthinellumUV-0S(A)和突變株UV-3S(B)不同生長時間細胞壁幾丁質紅外光譜研究Fig.5 FT-IR spectrum of chitin in the cell wall ofPenicillium janthinellum UV-0S(A)and mutant strain UV-3S(B)with different growth time

3 結論

本研究以本實驗室保存的一株海洋絲狀真菌UV-0S為出發(fā)菌株，經多級紫外誘變獲得一株高產CDA的突變菌株UV-3S，其胞外CDA酶活力是出發(fā)菌株的2.1倍。經發(fā)酵特性研究得出，突變菌株UV-3S與出發(fā)菌株UV-0S的發(fā)酵特性基本一致，突變株UV-3S產CDA的最適初始pH值為9.0，最適無機鹽為NaH2PO4，膠體幾丁質最適添加量為0.5%，在此最優(yōu)條件下，突變株UV-3S的CDA酶活力最高，為11.83 U/mL，說明CDA是一種誘導酶。菌株UV-3S的細胞壁幾丁質的DD值隨著真菌生長而增加，并在96 h顯示最高的N-脫乙酰化。表明CDA可能參與細胞生長的各個階段中殼聚糖的形成，這有助于細胞壁主要結構的形成，并影響自噬階段真菌細胞壁的破壞，為進一步了解CDA生產機理提供了理論依據[32]。