濃香型白酒窖泥中乳酸菌的分離鑒定及其在柑橘酒中的應用

沈 馨，馬佳佳，劉文匯，楊少勇，張振東，郭 壯*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北古襄陽酒業有限公司，湖北 襄陽 441100）

作為柑橘深加工的重要領域，以柑橘為原料進行果酒釀制，不僅促進了柑橘產業的多元化發展，而且提高了農產品的附加值[1]。雖然柑橘酒富含有機酸和維生素等多種營養成分，但其存在酸味和苦味偏重的不足[2]，在一定程度上降低了消費者對產品的喜好程度，因而積極尋求改善柑橘酒口感的方法是極為必須的。

果酒發酵過程中適當的有機酸可平衡酒中的苦澀味，而有機酸含量過高亦會導致果酒口感酸澀[3]。目前研究人員多采用工藝優化的方法，通過添加蔗糖[4]和糯米粉[5]的方式改善柑橘酒的風味。通過將蘋果酸分解為乳酸同時引起其他有機酸的變化，在果酒發酵過程中添加乳酸菌亦可顯著改善果酒的口感[6]。作為濃香型白酒窖泥中的重要功能菌群，適當的乳酸菌產生的乳酸除具有調和酒味的緩沖功能外，亦可與酒精生成乳酸乙酯，具有提升濃香型白酒品質的作用[7]。除此之外，窖泥中的乳酸菌具有較強的酒精耐受性[8]，因而從濃香型白酒窖泥中分離乳酸菌并對其在柑橘酒中的應用潛力進行評價是較為可行的。

在對濃香型白酒窖泥中乳酸菌進行分離鑒定的基礎上，將其與酵母菌聯合發酵進行柑橘酒制備，采用電子舌對柑橘酒滋味品質進行評價的同時，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對柑橘酒中有機酸的種類和含量進行了解析，通過本研究的實施以期為后續柑橘酒相關產品的開發提供數據支撐和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘（品種為宮川）、白砂糖：市售；果膠酶（50000U/g）：和氏壁生物技術有限公司；偏高活性葡萄酒果酒干酵母（其中菌株為釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；牛肉膏、酵母膏、檸檬酸銨、吐溫-80、瓊脂、葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、蛋白胨、檸檬酸二銨、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、氯化鈉、酚、異戊醇、氯仿、乙酸鈉、乙醇、乙二胺四乙酸、碳酸鈉和碳酸鈣：國藥集團化學試劑有限公司；MRS培養基：青島海博生物技術有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）聚合酶、2×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）mix、10×PCR buffer和T-載體：北京全式金生物技術有限公司；引物（27F/1495R）：武漢天一輝遠生物科技有限公司合成；內部液、參比溶液、陰離子溶液和陽離子溶液：日本Insent公司；草酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸和酒石酸標準品（純度＞98%）：西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1100紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；250B數顯生化培養箱：金壇市榮華儀器制造有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DG250厭氧工作站：英國DWS公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；FluorChem FC3化學發光凝膠成像系統：美國FluorChem公司；LC-20ADXR高效液相色譜儀及Inertsil ODS-SP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）：日本島津公司；SA-402B電子舌（配置CA0、C00、AE1、CT0和AAE測試傳感器）：日本Insent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

從湖北古襄陽酒業的窖泥車間隨機選取3個窖池，編號分別為A、B和C，從每個窖池的上層（距地面20 cm）、中層和底層分別挖取100 g左右窖泥，同一窖池的窖泥混合均勻后裝入樣品瓶中，置于冰盒中運回實驗室進行乳酸菌的分離。

1.3.2 窖泥乳酸菌的分離純化及DNA提取

將窖泥樣品10倍梯度稀釋后，取3個適宜的梯度涂布于含有1%碳酸鈣的MRS固體培養基中，37℃厭氧培養2 d，選取菌數在30～300之間的梯度進行菌落形態記錄。取有透明圈的單菌落劃線，純化3次之后，進行過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色。將過氧化氫酶試驗結果為陰性和革蘭氏染色結果為陽性的純菌株暫定為疑似乳酸菌[9]。使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法對菌株基因組DNA進行提取[10]，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 16S rDNA的PCR擴增

擴增體系：正反向引物各0.5μL，模板0.5μL，dNTP2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，Taq酶0.2μL，超純水18.8μL。其中正反向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物為1495R：5'-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3'[11]。

擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環30次；72℃延伸10 min；4℃保溫[11]。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將擴增成功的聚合酶鏈式反應（PCR）產物進行純化、連接、轉化以及鑒定，并將鑒定出的陽性克隆子的菌液寄往南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。將測出的序列與NCBI數據庫進行BLAST同源性比對[12]，以確定其分子學地位，并使用MEGA7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.4 菌株乙醇耐受性的測定

將活化3代的菌株分別接種于乙醇含量分別為0、3%、5%、7%的MRS液體培養基中，在37℃的條件下培養48 h后，在波長600 nm處測定其OD600nm值。

1.3.5 柑橘酒的制作

將成熟的柑橘去皮、分瓣和打漿裝入1 L玻璃瓶中→添加偏重亞硫酸鉀（90 mg/L）→添加100 mg/L果膠酶→用碳酸鈉調pH值為6.0，用白砂糖調整糖度為20°Bx→常溫放置12 h→添加200 mg/L干酵母→控溫發酵（22℃，6 d）→酒渣分離→按照5×106CFU/mL柑橘酒的接種量接種乳酸菌→后發酵（18℃，20 d）→陳釀→澄清→過濾→殺菌→裝瓶

1.3.6 柑橘酒滋味品質的評價

參照郭壯等[13]的方法進行測定。傳感器CAO、AE1、COO、AAE和CTO首先測得參比溶液電勢Vr，然后測得柑橘酒的電勢Vs，在參比溶液中洗滌后，傳感器COO、AE1和AAE測得參比溶液電勢Vr'。Vs-Vr即為酸、苦、澀、咸和鮮味5個基本味的相對強度；Vr-Vr'即為柑橘酒后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）的相對強度。

1.3.7 柑橘酒有機酸的測定

將乳酸、草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸和蘋果酸的標準樣品用超純水配制成0.001～3 g/L的梯度，根據有機酸濃度和色譜峰峰面積進行線性擬合。

樣品處理：取2 mL樣品加200 μL磷酸，流動相定容至10 mL，混勻后用0.22 μm水相濾膜過濾備用。

色譜條件：流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH2.9），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣體積為10 μL，色譜柱為C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器為紫外檢測器，檢測波長為215 nm[14-15]。

1.3.8 柑橘酒理化指標的評價

使用Mega7.0 軟件（http：//www.megasoftware.net/）繪制系統發育樹，其他圖均使用Origin 8.6軟件（OriginLab Corp，MA，USA）繪制。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌形態學觀察及16S rDNA同源性分析

從窖泥樣品中共分離出15株疑似乳酸菌菌株，顯微鏡下觀察均為短桿，所有菌株的菌落均為圓形、顏色為乳白色且邊緣光滑整齊。所有菌株過氧化氫酶均為陰性，革蘭氏染色均為陽性。在提取疑似乳酸菌菌株DNA基礎上，本研究通過16S rDNA同源性分析對15株疑似乳酸菌菌株進行了鑒定，進而確定了其分類學地位，15株菌16S rDNA序列分析結果如表1所示。

表1 15株菌的16S rDNA序列分析結果Table 1 16S rDNA sequence analysis of 15 strains

由表1可知，15株疑似乳酸菌均被鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），且與L.paracaseiR094 16S rDNA序列同源性均為99%，由此可見，L.paracasei是古襄陽窖泥中的優勢乳酸菌。

在已知同源性比對結果的基礎之上，本研究進一步使用MEGA7.0軟件以鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，標準序列中包括作為系統發育樹外群序列的L.brantaeSL1108和L.curvatusJCM 1096以及系統發育樹外群序列的L.zeaeRIA 482和L.rhamnosusNBRC 3425，系統發育樹如圖1所示。

圖1 15株乳酸菌的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 15 lactic acid bacteria strains

由圖1可知，15株菌株和2株內群菌株形成了第一類群，而外群菌L.brantaeSL1108和L.curvatusJCM1096分別形成了第二類群和第三類群，且15株菌株的16S rDNA序列同源性均為99%，均鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。

2.2 窖泥乳酸菌菌株乙醇耐受性的測定

在明確各菌株分類學地位的基礎之上，本研究評價了15株乳酸菌的乙醇耐受性，結果如圖2所示。

圖2 乳酸菌菌株酒精耐受試驗結果Fig.2 Alcohol tolerance test results of lactic acid bacteria strains

由圖2可知，15株乳酸菌在含7%乙醇的MRS培養基中仍然可以生長，說明其具有較好的乙醇耐受性。隨著乙醇含量的升高，乳酸菌的生長受到了明顯的抑制（P＜0.05）。

2.3 柑橘酒滋味品質的評價

為了進一步研究添加乳酸菌對柑橘酒滋味品質的影響，本研究采用電子舌技術對果酒各滋味指標的相對強度值進行了測定，結果如圖3所示。

由圖3可知，添加乳酸菌后柑橘酒苦味、咸味、鮮味和豐度（鮮味的回味）相對強度呈現下降趨勢，澀味相對強度呈現上升趨勢，而酸味、后味A（澀味的回味）和后味B（苦味的回味）因使用菌株發酵特性的不同呈現出不同的變化趨勢，這說明在后發酵過程中添加乳酸菌會顯著影響柑橘酒的滋味品質。值得一提的是，酸味是15株乳酸菌發酵而成的柑橘酒樣品間差異最大的指標，這可能與乳酸菌菌株產酸和蘋果酸-乳酸發酵能力不同有關。為了進一步探討添加乳酸菌對柑橘酒酸味的影響，采用HPLC技術對柑橘酒中的有機酸含量進行了測定，結果如圖4所示。

圖3 柑橘酒各滋味指標的相對強度值Fig.3 Relative intensity of each taste index in orange wine

圖4 柑橘酒有機酸的種類和含量Fig.4 Types and contents of organic acids in orange wine

由圖4可知，柑橘酒中的有機酸主要是乳酸、檸檬酸和琥珀酸，添加乳酸菌可明顯提升果酒中乳酸的含量，并降低琥珀酸的含量。除此之外，添加乳酸菌的果酒中蘋果酸的含量也較對照組低，說明蘋果酸-乳酸發酵過程可以將蘋果酸轉為乳酸。L.paracaseiJNC1-1、L.paracaseiJNB2-1、L.paracaseiJNB1-3和L.paracaseiJNB1-2可明顯降低7種有機酸的總含量，而L.paracaseiJNC2-1、L.paracaseiJNB2-2、L.paracaseiJNA2-3和L.paracaseiJNA2-1可提高果酒中乳酸菌的含量。由此可見，不同乳酸菌菌株的發酵特性是具有較大差異的。

在解析果酒各滋味指標相對強度和有機酸差異的基礎之上，本研究采用主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）對果酒滋味品質進行了進一步評價，柑橘酒滋味品質的因子載荷圖如圖5所示。

圖5 柑橘酒滋味品質的因子載荷圖Fig.5 Factor loading graph of taste quality in orange wine

由圖5可知，第一主成分由咸味和鮮味2個指標組成，其貢獻率為88.95%；第二主成分由豐度（鮮的回味）、澀味、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）、苦味和酸味6個指標所組成，其貢獻率為8.50%。柑橘酒滋味品質的主成分1與主成分2因子得分圖如圖6所示。

圖6 柑橘酒滋味品質的因子得分圖Fig.6 Factor score graph of taste quality in orange wine

由圖6可知，在水平方向上，相對于對照組而言，添加乳酸菌的樣品在因子得分圖上的分布整體偏右，結合因子載荷圖可知，添加乳酸菌發酵后柑橘酒的鮮味和咸味減弱。L.paracaseiJNB1-3在空間排布上較之其他添加乳酸菌的樣品偏左上，結合因子載荷圖可知，添加該株菌可明顯降低柑橘酒的酸味和苦味。由此可見，L.paracaseiJNB1-3在后續柑橘酒發酵中可能具有一定的應用潛力。

3 結論

從濃香型白酒窖泥中共分離出了15株乳酸菌，經鑒定均為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），為古襄陽酒業窖泥中的優勢乳酸菌。柑橘酒中的有機酸主要為乳酸、檸檬酸和琥珀酸，酸味是15株乳酸菌發酵而成的柑橘酒樣品間差異最大的指標。在后發酵過程中添加乳酸菌會顯著影響柑橘酒的滋味品質，L.paracaseiJNB1-3可明顯降低柑橘酒的酸味和苦味，在后續相關產品開發中可能具有一定的應用潛力。