羊Toll樣受體研究進展

何向東

（巴中市南江黃羊科學研究所 636600）

傳染病能降低羊生產性能，目前在畜牧業生產實踐中控制措施基本應用抗菌藥物，這往往會導致抗生素耐藥菌株的發生。因此，動物疫苗接種，這必是行之有效的管理措施。對于動物而言，先天免疫系統是防御微生物感染的屏障，而絕大多數動物對病原體的處理完全依賴于先天免疫識別。脊椎動物已經進化出一個更復雜的防御系統，稱為適應性免疫系統，以對病原體形成先天抵抗力。先天免疫系統能夠識別微生物及其微生物代謝產物，通過編碼的受體識別而發揮作用[1]。Toll樣受體(Toi-like receptors，TLRs)是參與天然免疫過程中病原相關分子模式(Pathogen associtated molecular patterns, PAMPs)的特異性模式識別受體(Pathogen recognition receptors, PRRs),當與其相應PAMPs分子結合后，以誘導免疫應答和炎性反應的生物學功能。TLRs作為研究PRRs的熱點之一，目前羊的TLRs已克隆出10個類型[2]。先天免疫系統的PRR中，尤其是Toll樣受體(TLR)家族負責啟動急性炎癥反應，通過誘導抗微生物以對抗入侵的病原體基因和炎癥細胞因子[3]。TLR信號可活化吞噬細胞和直接殺死傳染性微生物，脊椎動物的免疫系統識別特定序列環境（CpG基序）中未甲基化的CpG，這在細菌基因組中比在脊椎動物基因組中更為普遍[4]。鑒于TLRs基因的表達和突變與炎癥病理具有較高的相關性。因此，本文對羊的TLR家族進行綜述，以期為羊的抗病育種提供重要理論支撐。

1 TLRs生物學結構及功能

TLRs作為I型跨膜糖蛋白，由胞外區、胞內信號區和跨膜區組成，其中胞外區特點在于其具有富含亮氨酸重復序列。該序列與宿主抗感染反應特異性相關，生理學功能在于可實現空間結構的變化來達到TLRs對病原成分進行識別。此外，跨膜區其特點在于富含半胱氨酸，該結構域生物學功能在于可決定TLRs分子的亞細胞定位。胞內信號區也被稱為稱Toll-IL-1受體(Tol-IL-1 receptor, TIR)結構域，與白介素-1受體家族的胞內區具有高度同源性，結合部位位于細胞內的髓樣分化因子接頭，誘導對應的免疫應答，阻止病原微生物的侵襲[5]。

激發TLR配體至少包括兩個重要的信號通路，一是涉及MyD88的神經節蛋白由TLR激發，從而導致激活轉錄因子NF-κB和促炎-釋放傳導性細胞因子。二是驅動第二種途徑抗原呈遞細胞的成熟并增加MHC分子，共同刺激分子CD40和趨化因子受體CCR7的表達。以上信號均是被認為對T細胞介導的啟動起著至關重要的免疫信號通路[6]。

2 羊TLRs研究現狀

2.1 TLR4

Toll 樣受體 4 (TLR4) 是一種模式識別受體(PRR) 在先天免疫和宿主中起關鍵防御作用。TLR4是脂多糖 (LPS) 的關鍵信號轉導器，LPS 是革蘭氏陰性菌的主要胞外成分。TLR4的激活可以促進細胞增殖和凋亡[7]。

TLR4通過下游適配器來激活主要反應基因88（MyD88）和含TIR結構域的銜接子-誘導干擾素-α-（TRIF-α）依賴的途徑，通過核因子-kβ-（NF-kβ-）起作用的生理機制[8]。TLR4在轉基因綿羊中的過表達可能會加速刺激脂多糖分泌，通過NO生成來清除入侵微生物。此外，TLR4過表達也增強鳥苷三磷酸環水解酶（GCHI）活性，該酶是四氫生物蝶呤的限速酶（BH4）合成酶，這對于生產誘導型一氧化氮合酶來說必不可少[9]。急慢性呼吸道引起羊生產性能降低甚至死亡，呂偉麗[10]選擇TLR4、TLR9基因作為研究對象，分析該基因的遺傳多態性及變異特征，采用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)對山丹縣、隴西縣和永昌縣表型正常作為對照組和患有呼吸道疾病作為試驗組的小尾寒羊TLR4基因外顯子3和TLR9基因的多態性進行檢測，結果發現小尾寒羊TLR4外顯子3的AA、AB基因型與抗呼吸道疾病感染的遺傳潛力有關。這些依據對小尾寒羊的遺傳特性和生產利用提供基礎數據。

2.2 TLR7

梁田等[11]對新疆薩福克羊Toll樣受體7基因單核苷酸進行多態性分析，采集新疆地區種羊場薩福克羊血液，采用PCR-SSCP方法進行檢測，對突變位點進行測序分析，序列比對分析存在A343G、A350G、A1244G的錯義突變,氨基酸改變分別是Lys→Gln, Asp→Ser, Glu→Arg，且突變都發生在胞外區亮氨酸重復區內；帶型AB是位點A343G和A350G同時發生突變；以上突變可能改變TLR7基因的功能，進而影響免疫應答，為探索綿羊TLR7基因多態性與抗病力的關系和提高羊抗病育種提供候選分子標記。

2.3 TLR9

Zhou等[12]共發現羊4個SNP位點，其中1323 C/T 、1340 G/A、1384 G/T 和1452 G/A，其中第2個和第3個分別發生Arg/Gln 447 和Ala/Ser 462 氨基酸變化，這種替代會影響TLR9的功能，因而對疾病有易感性。TLR9基因可以作為小尾寒羊抗呼吸道疾病的候選基因，AA型可以作為小尾寒羊抗呼吸道疾病的標記基因型[10]。

回腸或空腸中TLR1-5和8的表達增加，腸系膜淋巴結中TLR1-4、6和8的表達增加。與未暴露的動物相比，暴露的周邊血液單核細胞中TLR1、2和6-8的表達有增加的趨勢。這些差異結果有助于探明反芻動物約翰氏病中TLR表達的情況和助于解釋發病機理，在將來診斷副結核病感染中有重要作用[13]。以塔什庫爾干羊、和田羊和多浪羊共107個樣本為研究對象，采用PCR、測序法和生物信息學方法分析TLR9基因的SNP及氨基酸差異。發現7個SNP，其中3個位點為同義突變，4個位點為非同義突變，確定為12個等位基因，其中新發現6個等位基因。首次發現氨基酸G437R的突變，可能影響機體對PAMP的識別。綿羊TLR9基因外顯子2具有較高的多態性，導致LRR空間結構發生改變，進一步影響機體對疾病的感受性，這為新疆南疆地區綿羊抗病育種提供基礎數據[14]。

PCR-SSCP分析來研究綿羊TLR9基因關鍵區域的遺傳變異，確定了代表三種不同序列的三種新型SSCP 模式。在單個綿羊中檢測到存在不同的序列，并且所有鑒定的序列與來自多種物種的TLR9序列具有高度同源性，表明這些序列代表了綿羊TLR9 基因的等位基因變體。在擴增的區域中檢測到四個單核苷酸多態性 (SNP)，其中兩個是會導致氨基酸變化的非同義替換。這里檢測到的變異可能對 TLR9 的結構和/或功能產生影響，從而影響對病原體的免疫反應[14]。

3 展望

TLRs在作為識別、啟動、激發病原體的重要免疫應答調控分子，已成為羊抗病育種的研究熱點。目前國內外學者對TLRs的研究主要集中于消化道和呼吸道疾病，對其他疾病研究還知之甚少。因此，TLRs抗病的分子機制是否與其他降低羊生產性能疾病有效，且在遺傳選育中作為抗病標記分子還需要做一步研究。