應用生物信息學技術篩選結直腸腺瘤相關基因

陳林波 洪芬芬 許豐

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發病率在男性所有惡性腫瘤中位居第3位，女性中排到第2位[1]。2012年，全球范圍內約有140萬新發結直腸癌病例，并且有近70萬例死于結直腸癌[1]。因此，對結直腸癌的早發現、早診斷、早治療至關重要。正常結直腸黏膜-結直腸腺瘤-結直腸腺癌被認為是結直腸腺癌形成的經典途徑[2]，可見作為結直腸腺癌的上游環節，了解結直腸腺瘤發生、發展的分子機制并進行深入研究有助于結直腸腺癌的早期診治。高通量芯片技術的快速發展為人類研究疾病基因表達譜與分子機制提供了巨大幫助[3]，如對結直腸腺癌及配對癌旁組織行芯片分析可篩選出結直腸腺癌相關基因及關鍵信號通路[4]，但目前對結直腸腺瘤的相關研究報道少見。本研究從基因芯片公共數據庫Gene Expression Omnibus（GEO）下載結直腸腺瘤基因芯片，采用生物信息學技術對其分析后篩選出結直腸腺瘤與正常結直腸黏膜的差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs），之后對DEGs進行功能注釋，同時構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction,PPI）網絡，進一步篩選出關鍵基因，以期為尋找結直腸腺瘤和腺癌的早期診斷標志物及治療靶點提供理論依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 數據來源 從美國國立生物技術信息中心（NCBI）公共數據平臺GEO數據庫下載結直腸腺瘤基因芯片數據 GSE8671，芯片平臺是 GPL570（HG-U133_Plus_2，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）。該芯片包含32例結直腸腺瘤組織和32例正常結直腸黏膜組織的基因表達矩陣數據。

1.2 DEGs篩選 應用R語言軟件limma包[5]對GEO數據庫下載的結直腸腺瘤基因表達矩陣進行差異分析，篩選出結直腸腺瘤與正常結直腸黏膜組織的DEGs。篩選標準：log2基因表達差異倍數（foldchange，FC）絕對值≥2，P＜0.05。

1.3 DEGs的基因本體論（gene ontology,GO）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes）分析 應用生物信息學在線分析工具DAVID（https∶//david.ncifcrf.gov/）[6]對DEGs的GO及KEGG分析，得到DEGs功能富集分析和信號通路分析數據。校正P＜0.05為差異有統計學意義。

1.4 DEGs的PPI網絡分析 利用Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes （STRING,https∶//string-db.org/）數據庫[7]分析結直腸腺瘤DEGs間的PPI網絡關系，combined score＞0.4視為差異有統計學意義。將得到的PPI網絡導入Cytoscape軟件[8]，找出網絡中處于中心位置的關鍵節點蛋白，得出關鍵基因。

2 結果

2.1 DEGs篩選結果 在結直腸腺瘤與正常結直腸黏膜組織中共篩選出381個DEGs，其中上調基因248個，下調基因133個，見圖1a；對差異表達最大的50個基因進行聚類分析，其結果見圖1b。

圖1 結直腸腺瘤DEGs篩選結果

2.2 DEGs的GO分析結果 GO分析結果顯示，對于上調的248個DEGs，其生物學過程（biological process,BP）主要富集于碳酸氫根轉運、趨化因子介導的信號通路、鈉離子轉運等（圖2a），細胞成分（cellular component,CC）富集于細胞外間隙、細胞外泌體、蛋白性細胞外基質等（圖2b），分子功能（molecular function,MF）富集于激素激活、趨化因子激活、趨化因子與受體結合等（圖2c）；對于下調的133個DEGs，其BP主要富集于趨化因子介導的信號通路、炎癥反應、免疫反應等（圖2d），CC富集于細胞外間隙、細胞外泌體、蛋白性細胞外基質等（圖2e），MF富集于趨化因子激活、CXCR趨化因子與受體結合、鈣離子結合等（圖 2f）。

2.3 DEGs的KEGG分析結果 KEGG分析結果顯示，上調的248個DEGs主要涉及消化液分泌、藥物代謝、趨化因子受體相互作用等（圖3a）；下調的133個DEGs主要富集于趨化因子信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、軍團菌感染等（圖3b）。

圖2 DEGs的GO分析結果

圖3 DEGs的KEGG分析結果

2.4 DEGs的PPI網絡分析結果 利用STRING數據庫對結直腸腺瘤DEGs進行分析，結果發現其PPI網絡由247個節點蛋白和579條相互作用關系構成（圖4），將輸出結果導入Cytoscape軟件進一步篩選關鍵基因（圖5），排名前10的中心節點蛋白分別是IL-8、趨化因子CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、 趨 化 因 子CCL19、CCL20、前血小板堿性蛋白（PPBP）、血小板因子4（PF4），對應的關鍵基因分別是 IL-8、CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、CCL19、CCL20、PPBP、PF-4。

3 討論

結直腸癌發生、發展是一個復雜而又漫長的過程，其分子機制涉及多個基因的改變[9]。雖然近年來結直腸癌相關研究不斷增多，但目前對其所知仍然十分有限，尋找結直腸癌關鍵基因并研究其分子機制意義重大。近幾年快速發展的高通量芯片技術能夠在全基因組水平研究疾病的基因表達譜，為分子水平探索人類疾病發生機制提供了重要技術支持[3]。生物信息學作為一門新興的交叉學科，可以通過整合生物學、計算機、數學這些不同學科的優勢對生物學數據進行挖掘分析，獲取需要信息并進一步深入研究，最終為研究疾病分子機制提供理論依據。目前生物信息學技術已經被廣泛地應用于分析高通量芯片、轉錄組測序等數據，它能夠發現疾病發生、發展過程中的關鍵基因并預測其可能的生物學功能[10]，從而找出疾病新的診治靶點，對疾病診斷標志物的研究和新藥的研發具有重要意義。

圖4 DEGs的PPI網絡

圖5 PPI網絡中前10個關鍵基因

本研究應用生物信息學技術對結直腸腺瘤基因芯片GSE8671進行分析，共篩選出了381個DEGs，其中248基因在結直腸腺瘤中表達上調，133個基因在結直腸腺瘤中表達下調。對DEGs進行GO功能注釋分析，發現生物學功能主要與激素激活、趨化因子激活、趨化因子受體結合等密切相關，而KEGG信號通路分析發現DEGs主要參與趨化因子信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、藥物代謝等信號通路。用STRING數據庫和Cytoscape軟件分析DEGs的PPI網絡，篩選出處于最核心位置的10個關鍵基因，分別是 IL-8、CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、CCL19、CCL20、PPBP、PF-4。

本研究結果顯示，炎癥反應中的各類細胞因子可能在結直腸腺瘤的發生、發展過程中發揮著關鍵作用。事實上人類許多腫瘤的發生、發展過程中都伴有慢性炎癥反應，炎癥可以通過釋放細胞因子、產生自由基、損傷DNA，促進血管生成和細胞增殖等而促進腫瘤進展[11]。結直腸癌是一種公認與慢性炎癥密切相關的惡性腫瘤[12]。目前的研究結果顯示TNF-α、轉化生長因子β（TGF-β）、干擾素 γ（IFN-γ）、IL-6、IL-8 等細胞因子均參與結直腸癌的發生、發展[13]。如TNF-α是由單核巨噬細胞分泌的一種細胞因子，在病理情況下TNF-α可以促進NF-κB表達，而NF-κB又進一步通過上調細胞周期蛋白 D1（cyclin D1）、血管內皮生長因子（VEGF）等基因發揮促癌作用[14]。TGF-β對結直腸癌的影響和腫瘤發展階段有關，目前認為在早期結直腸癌中TGF-β主要發揮抑癌作用[15]，但其高表達卻與晚期結直腸癌患者的不良預后密切相關[16]，似乎又暗示TGF-β具有促癌作用，這看似矛盾現象的具體機制仍有待于進一步闡明，可見細胞因子對結直腸癌的影響和作用及其復雜。本研究通過PPI網絡篩選出10個關鍵節點蛋白均屬于細胞因子，除了IL-8為IL家族，其余9個均屬于趨化因子家族，其中PPBP也叫CXCL7，PF-4也叫CXCL4。IL家族中以IL-6和結直腸癌的關系被研究的最為透徹，研究發現IL-6同樣是NF-κB下游靶基因，當IL-6被異常激活后可以進一步通過糖蛋白130（gp130）上調癌基因信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）表達[17-18]，表明IL-6通過參與NF-κB/IL-6/gp130/STAT3通路在結直腸癌中發揮促癌作用。Cui等[19]發現IL-8表達水平在正常結直腸黏膜-結直腸腺瘤-結直腸腺癌進展過程中逐步遞增，研究認為IL-8主要通過結合趨化因子CXC受體1（CXCR1）和CXCR2后促進下游癌基因表達而引起結直腸腫瘤細胞增殖和血管生成[20]。CXC類趨化因子家族成員眾多并且功能各異，包括CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、CXCL7、CXCL4 在內的成員已經被越來越多的研究證實可以和各自配體結合后參與結直腸癌細胞生存、腫瘤生長、腫瘤轉移、血管生成等生物學過程[20-21]。作為CC類趨化因子的2個成員，CCL19在結直腸癌中發揮抑癌作用[22]，而CCL20卻能促進結直腸癌的進展并與腫瘤患者不良預后有關[23]，但具體機制目前仍不明確。

綜上所述，各類細胞因子尤其是趨化因子廣泛參與結直腸腺癌的發生、發展，本研究發現這些細胞因子同樣和結直腸腺瘤的發生密切相關，因此可以推測正是炎癥反應中的各種細胞因子促進了正常結直腸黏膜-結直腸腺瘤-結直腸腺癌這一演變過程。