黑蒜總酚的提取及抗氧化性研究

◎ 侯笑林，劉家岐，高 涵，楊延存

（青島工學院，山東 青島 266300）

黑蒜又名黑大蒜、發酵黑蒜、黑蒜頭，是將新鮮的生蒜帶皮放在高溫高濕的發酵箱里發酵60～90天，讓其自然發酵制成的食品[1]。黑蒜在保留生大蒜原有成分和功能的基礎上，使生大蒜的抗氧化、抗酸化功效提高了數十倍，又把生大蒜本身的蛋白質大量轉化成為人體所必需的8種氨基酸，進而被人體迅速吸收，對增強人體免疫力、恢復人體疲勞，保持人體健康起到巨大積極作用[2]。本文以黑蒜為原料，采用乙醇浸提法提取黑蒜中總酚，通過單因素試驗和正交試驗對其總酚的提取工藝條件進行優化，研究最佳提取工藝條件及顯著影響因素，以期提高黑蒜總酚的提取量，同時以體外抗氧化體系為模型，研究其抗氧化活性，為進一步開展黑蒜活性物質研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑蒜，網上采購，新鮮、無公害、無糜爛。

1.2 儀器與設備

DHG-9240A型BS電熱恒溫鼓風干燥箱（上海康路儀器設備有限公司）、40目篩、80-2電動離心機（上海梅香儀器有限公司）、數顯恒溫水浴鍋HH-6（上海梅香儀器有限公司）、數顯恒溫水浴鍋HH-4（常州市華普達教學儀器有限公司）、JM-B5102分析天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）、多功能粉碎機（鉑歐五金廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑蒜總酚提取流程[3-4]

黑蒜→去皮→清洗→烘干→粉碎、過篩→稱取黑蒜粉末樣品→按一定料液比加乙醇溶液→恒溫提取→離心分離→上清液冷藏。

1.3.2 黑蒜總酚提取率的測定及計算方法[5]

以焦性沒食子酸為標準品，準確稱取20 mg，用水溶液溶解，定容到100 mL容量瓶中，得0.2 mg/mL標準沒食子酸溶液。分別準確移取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于6支25 mL納氏比色管中，加入Folin-ciocalteu試劑1.0 mL，搖勻后加入15%碳酸鈉溶液2 mL，定容至10 mL，搖勻，放置2 h，于波長760 nm處測定吸光度，以焦性沒食子酸含量（mg/mL）為橫坐標，以對應的吸光度值為縱坐標，制作標準曲線。

吸取一定體積粗多酚溶液于比色管中，按上述步驟測定其測定吸光度，并在標準曲線上得出相應的濃度，計算總酚提取量。

W=C×V/m

式中：W為總酚提取量，單位為mg/g；C為Folinciocalteu法測定的提取液質量濃度，單位為g；V為提取液體積，單位為mL；m為黑蒜粉末質量，單位為g。

1.3.3 單因素試驗

（1）乙醇體積分數對黑蒜總酚提取量的影響。準確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，按照料液比1∶25分別加入體積分數10%、30%、50%、70%和90%的乙醇溶液，在50 ℃提取溫度條件下提取40 min，離心分離，以總酚提取量為評價指標，確定最佳乙醇體積分數。

（2）料液比對黑蒜總酚提取量的影響。準確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，分別按料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30加入體積分數50%乙醇溶液，在50 ℃提取溫度條件下提取40 min，離心分離，以總酚提取量為評價指標，確定最佳料液比。

（3）提取溫度對黑蒜總酚提取量的影響。準確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，按料液比為1∶25加入體積分數50%乙醇溶液，分別在提取溫度為30、40、50、60 ℃和70 ℃條件下提取40 min，離心分離，以總酚提取量為評價指標，確定最佳提取溫度。

（4）提取時間對黑蒜總酚提取量的影響。準確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，按料液比為1∶25加入體積分數50%乙醇溶液，在50 ℃提取溫度條件下分別提取20、40、60、80 min和100 min，離心分離，以總酚提取量為評價指標，確定最佳提取時間。

1.3.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、料液比、提取溫度、提取時間四因素進行正交試驗，每個因素設計三個水平，以總酚提取量為評價指標，設計L9（34）正交試驗，優化黑蒜總酚提取工藝條件。

1.3.5 黑蒜總酚抗氧化活性的測定

（1）DPPH清除作用的測定[6-7]。取不同質量濃度樣品溶液4 mL于試管中，依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反應20 min，在517 nm處測定吸光度。以蒸餾水做空白。以相同濃度維生素C作對比。

式中，A1為4 mL樣液+2 mL DPPH對應吸光度值；A2為4 mL樣液+2 mL 95%的乙醇對應吸光度值；A3為4 mL蒸餾水+2 mL DPPH對應吸光度值。

（2）超氧自由基（O2-）清除作用的測定[8-9]。采用鄰苯三酚自氧化法測定，取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液4.0 mL，于25 ℃水浴中保溫20 min，分別加入不同質量濃度1 mL樣液和1 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻于25 ℃水浴中反應5 min，加入8%的HCl 1 mL終止反應，325 nm處測定吸光度（A）。用蒸餾水做空白。以相同濃度維生素C作對比。

式中，Ai為4 mL Tris-HCl+1 mL樣液+2 mL鄰苯三酚對應吸光度值；Aj為4 mL Tris-HCl+1 mL樣液+2 mL蒸餾水對應吸光度值；Ac為4 mL Tris-HCl+1 mL蒸餾水+2 mL鄰苯三酚對應吸光度值。

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數對黑蒜總酚提取量的影響

從圖1可知，乙醇體積分數在10%～50%時，黑蒜中總酚的提取量逐漸升高，且在50%時達到最高，原因可能是多酚類物質在乙醇水溶液中的溶解度逐漸增大。當乙醇體積分數達到50%以上時，總酚提取量呈現出下降趨勢，這可能是由于提取液中除多酚外的其他雜質逐漸增多，同時提取溶劑中水分減少，造成測定體系中多酚含量降低，測定數據下降。因此確定最佳的乙醇體積分數為50%。

圖1 乙醇體積分數對黑蒜總酚提取量的影響圖

2.2 料液比對黑蒜總酚提取量的影響

料液比是影響原料中總酚提取的因素之一。適當的料液比即可使原料中的多酚物質得到充分提取，還可減少溶劑的消耗及其回收成本。由圖2可以看出，隨著料液比的增加，總酚的提取量逐漸增加，在料液比為1∶10～1∶20時總酚提取量增加的幅度較為明顯；但是當料液比大于1∶20時，總酚提取量增加的幅度不大，表明當料液比增大到1∶20時原料中的多酚類物質已被充分提取出來，總酚提取量達到峰值，因而繼續增大料液比，總酚提取量不會明顯提高，而且在實際生產中還造成溶劑浪費。因此，確定最佳的料液比為1∶20。

圖2 料液比對黑蒜總酚提取量的影響圖

2.3 提取溫度對黑蒜總酚提取量的影響

由圖3可知，30～50 ℃時，總酚提取量隨溫度的升高而增大，在50 ℃是總酚提取量最高。這是由于隨著溫度升高，分子運動速度加快，隨溫度上升產生的大量熱能破壞了黑蒜內各物質之間的氫健和疏水健，大量多酚類物質的滲透、溶解、擴散速度加快，從而促進了原料中多酚類物質的溶出，是總酚提取量得以提高。60～70 ℃時，總酚提取量反而呈現下降趨勢，這是由于多酚類物質的穩定性較差或者長時間受熱影響了多酚氧化酶的催化能力，自身發生氧化或水解反應所致。因此，黑蒜中總酚提取的溫度不宜過高，以50 ℃為宜。

圖3 提取溫度對黑蒜總酚提取量的影響圖

2.4 提取時間對黑蒜總酚提取量的影響

從圖4可以看出，黑蒜中總酚的提取量隨提取時間的延長呈現出先增加后下降的趨勢，在60 min時達到峰值，60 min后隨著時間的延續，總酚提取量出現下降。這可能是因為隨著時間的增加，黑蒜中多酚物質的溶解程度逐漸增強，而在60 min時達到峰值后，多酚的溶出已經接近于飽和，再繼續增加提取時間的時候，析出的多酚由于受光、熱、多酚氧化酶等各種外界因素的影響，極易被氧化。因此，60 min后反而隨著時間的增加多酚提取量出現下降的情況。因此，確定最佳提取時間為60 min。

圖4 提取時間對黑蒜總酚提取量的影響圖

2.5 正交試驗優化

由表1可知，試驗中4個因素的影響力大小順序為A＞D＞B＞C，對應影響黑蒜總酚提取效果因素的強弱順序為乙醇體積分數＞提取時間＞料液比＞提取溫度，且黑蒜總酚提取的最佳提取工藝為A2B2C3D2。由于計算出的最優組合不包含在正交表中，因而按最優組合配方進行驗證試驗，得出黑蒜總酚提取量為1.82 mg/g，因此確定A2B2C3D2為提取黑蒜總酚的最佳工藝條件，即乙醇體積分數50%、料液比1∶20、提取溫度60 ℃、提取時間60 min。

表1 正交試驗結果表

2.6 黑蒜總酚對DPPH清除率的影響

對DPPH清除率的實驗結果如圖5所示。由圖可見，黑蒜總酚具有較強的清除DPPH的能力，隨著黑蒜總酚溶液濃度的增大，清除能力顯著提高。在濃度為0.5 mg/mL時，黑蒜總酚對DPPH清除率為56.8%，而在相同濃度下，維生素C對DPPH的清除率僅為40.1%，表明黑蒜總酚對DPPH清除率比維生素C高。

圖5 黑蒜總酚與維生素C對DPPH清除率的影響圖

2.7 黑蒜總酚對O2-清除率的影響

圖6 黑蒜總酚和維生素C對清除率的影響圖

3 結論

（1）乙醇浸提法提取黑蒜總酚的最佳工藝條件為乙醇體積分數50%、料液比1∶20、提取溫度60 ℃、提取時間60 min，在此條件下，黑蒜總酚的提取量可達1.82 mg/g。

（2）黑蒜總酚對DPPH和O2-均表現出較強的清除能力，在一定濃度范圍內，清除率隨濃度增大而升高，且高于同濃度維生素C的清除率，說明黑蒜總酚的抗氧化性能較強。通過對所得總酚品質特性的研究，為黑蒜資源的綜合利用和黑蒜中多酚類物質開發應用提供理論依據。