耐多藥和廣泛耐藥MTB的inhA基因突變與對丙硫異煙胺耐藥的相關性分析

宋艷華 王桂榮 霍鳳敏 劉榮梅 高孟秋 李琦

結核病目前仍是危害人類健康的重大傳染病，耐多藥結核病(MDR-TB)的出現和流行是目前全球結核病控制的重大挑戰。世界衛生組織(WHO)估計，2016年全球約有MDR-TB新發患者60萬例，而在中國估計每年MDR-TB新發約7.3萬例[1]。2016年，“WHOtreatmentguidelinesfordrug-resistanttuberculosis”中推薦，在MDR-TB治療組成方案中至少需要包括4種有效的藥物[2]，但是由于耐藥、治療費用及藥物不良反應等原因，選擇有效的、能持續應用的藥物組成方案較困難，特別是對于廣泛耐藥結核病(XDR-TB)。

異煙肼(INH)是治療結核病的核心藥物，其主要耐藥機制是katG和(或)inhA基因突變，katG突變可造成結核分枝桿菌(MTB)對高濃度INH耐藥，inhA突變菌株多為對低濃度INH耐藥[最低抑菌濃度(MIC)一般為0.2～1.0 mg/L]，inhA突變是二線抗結核藥物丙硫異煙胺(PTH)或乙硫異煙胺(ETH)的耐藥機制之一，并且是INH和ETH/PTH交叉耐藥的分子基礎[3]。已有研究證明了高劑量INH治療MDR-TB有效[4]。WHO推薦高劑量INH作為一種推薦藥物用于MDR-TB的治療[2]，主要推薦用于inhA突變導致的低濃度INH耐藥的結核病患者。為此，筆者選取MDR-TB和XDR-TB臨床分離株，分析其inhA突變情況與對PTH進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結果間的關聯性，以說明大劑量INH及PTH在耐藥結核病治療中的臨床應用價值，為臨床醫生選擇藥物提供借鑒。

資料和方法

1.研究對象：選取2016年2月至2017年2月首都醫科大學附屬北京胸科醫院確診的132例MDR-TB或XDR-TB患者作為研究對象。研究對象臨床分離株均培養陽性且鑒定為MTB，具有INH、利福平(RFP)、左氧氟沙星(Lfx)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)及PTH藥敏試驗結果，同時具有katG和inhA突變檢測結果。

2.細菌培養及藥敏試驗：按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》對標本進行處理，并在改良羅氏培養基(購自深圳銀科公司)上進行培養，培養陽性菌落采用分枝桿菌藥敏檢測試劑盒(購自深圳銀科公司)進行菌種鑒定和藥敏試驗。操作方法參考產品說明，臨界濃度分別為：INH 0.2 μg/ml、RFP 2 μg/ml、Lfx 2 μg/ml、Am 1 μg/ml、Cm 2.5 μg/ml、PTH 10 μg/ml，在這一濃度上生長定義為耐藥。

3.基因突變檢測：痰液和膿液等臨床標本先經過N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉法(NALC-NAOH)去污處理；支氣管肺泡灌洗液及其培養物直接取樣加入提取液，經加熱離心提取DNA，采用INH耐藥基因突變檢測試劑盒(購自廈門致善生物科技有限公司)進行熒光定量PCR熔解曲線分析[5]，記錄katG和inhA基因突變結果。

4.統計學分析：采用Excel 2007軟件進行數據收集，SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計數資料采用“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.藥敏試驗結果：根據表型藥敏試驗結果，132株臨床分離菌株中MDR-MTB有89株(67.4%)、前廣泛耐藥結核分枝桿菌(pre-XDR-MTB，即：在對INH和RFP耐藥的基礎上，同時對二線注射類藥物或氟喹諾酮類藥物中的一種藥物耐藥)有26株(19.7%)、XDR-MTB有17株(12.9%)。

2.耐藥基因突變情況：katG突變率(合并及不合并inhA突變)為73.5%(97/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為69.7%(62/89)、73.1%(19/26)、94.1%(16/17)；inhA單突變率(不含katG突變)為 15.9%(21/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為18.0%(16/89)、15.4%(4/26)、5.9%(1/17)。inhA+katG雙基因突變率在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為1.1%(1/89)、7.7%(2/26)、11.8%(2/17)。

3.對PTH表型耐藥與inhA突變的關系：菌株對PTH的總耐藥率為22.7%(30/132)，在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB中分別為11.2%(10/89)、30.8%(8/26)、70.6%(12/17)。XDR-MTB對PTH的耐藥率明顯高于MDR-MTB(χ2=30.57，P<0.01)和pre-XDR-MTB(χ2=6.55，P<0.05)。inhA突變率(合并及不合并katG突變)在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中分別為19.1%(17/89)、23.1%(6/26)、17.6%(3/17)；inhA突變菌株對PTH表型耐藥率分別為29.4%(5/17)、4/6、3/3。在MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB的PTH耐藥株中，分別有5/10、4/8、3/12發生inhA基因突變。無katG和inhA突變的14株菌對PTH均敏感。92株無inhA突變(單katG突變)株對PTH耐藥情況有差異：MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB菌株對PTH的耐藥率分別為8.2%(5/61)、23.5%(4/17)和64.3%(9/14)；XDR-MTB菌株對PTH的耐藥率明顯高于MDR-MTB和 pre-XDR-MTB菌株，差異均有統計學意義(χ2=20.05，P<0.01；Fisher精確概率法，P<0.05)。132株臨床分離株的表型藥敏試驗結果與耐藥基因突變的相關性見表1?？梢姡琈DR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中，katG仍為主要突變基因，且從MDR-MTB到XDR-MTB突變率升高，而inhA單基因突變率降低。從MDR-MTB到XDR-MTB，對PTH耐藥率明顯增加，而菌株inhA突變率低于其對PTH表型耐藥率。

表1 132株結核分枝桿菌臨床分離株的表型藥敏試驗結果與耐藥基因突變的相關性

討 論

MTB對INH的耐藥與許多基因突變相關，發生頻率最高的是katG編碼區和inhA突變，katG315突變最常見，有30%～94%耐藥株發生該突變[3，6]。inhA突變包括其啟動子區和編碼區突變，占對INH耐藥MTB菌株的8%～43%[4]，絕大多數菌株以啟動子區突變為主[3]。katG和inhA在對INH耐藥MTB菌株中的突變率具有地域性差異。本次研究結果顯示，MDR-MTB、 pre-XDR-MTB和XDR-MTB中inhA單突變率是18.0%、15.4%、5.9%。據報道，不同地區對INH耐藥MTB菌株inhA突變率(合并及不合并katG突變)不同，埃塞俄比亞為0.8%[7]，波蘭為4%[8]，菲律賓為22%[9]，中國廈門為27.8%[5]。南非研究顯示，MDR-MTB和XDR-MTB菌株inhA單突變率分別為14.8%和10.3%[4]。MTB菌株inhA基因突變與其對INH低度耐藥和PTH高度耐藥相關[3]，inhA突變而katG未突變的MTB菌株感染者可能將受益于高劑量INH的治療。筆者本次研究結果和南非的數據都顯示，隨著耐藥種類的增多(從MDR-MTB到XDR-MTB)，inhA單突變菌株有減少趨勢，推測在XDR-TB患者常規藥物治療方案中加用高劑量INH可能受益小于MDR-TB患者[4]。

本次研究顯示，MDR-MTB、pre-XDR-MTB、XDR-MTB菌株中inhA+katG雙基因突變率分別為1.1%、7.7%、11.8%，而南非地區研究顯示以上3種菌株中inhA+katG雙基因突變率分別為15%、43%、73%[4]，均高于本次研究結果。MTB菌株inhA基因突變是其INH、PTH/ETH交叉耐藥的分子基礎，南非地區研究顯示，XDR-MTB有較高的ETH耐藥，考慮為inhA突變所致[4]，inhA突變可作為預測MTB菌株對ETH耐藥及XDR-TB的分子標識。本次研究顯示，從MDR-MTB到XDR-MTB，inhA突變株對PTH的耐藥率逐漸升高，但在MDR-MTB中仍有部分inhA突變菌株對PTH敏感。而且，在XDR-MTB中inhA(合并及不合并katG突變)突變率不高(17.6%)，但是對PTH耐藥率為70.6%，所以不同于非洲MTB菌株特征；故本次研究中，XDR-MTB菌株中inhA突變可能不是對PTH產生耐藥的主要機制。PTH與ETH作為前藥，需要單加氧酶EthA蛋白激活作為活性形式(ETH-NAD或PTH-NAD)作用于inhA而發揮生物效應。inhA和ethA基因突變是MTB對ETH與PTH 耐藥的主要分子機制。Tan等[10]研究顯示，在46株對PTH耐藥的臨床分離株中，19株有ethA突變、22株有inhA(調控區或編碼區)突變。Vilchèze和Jacobs[3]報道，MDR-MTB對ETH的耐藥菌株中有54.2%～100.0%具有ethA突變。ethA突變也可能是XDR-MTB菌株對PTH產生耐藥的主要機制。另外，Tan等[10]研究顯示，MTB對Lfx耐藥可能與對PTH耐藥相關(OR=2.18，95%CI：1.02～4.63；P=0.04)，認為可能是MTB菌株暴露于氟喹諾酮而引起的氧自由基產生，從而誘導其發生對PTH耐藥相關基因的突變。因此，未檢測到inhA突變的菌株并不一定對PTH敏感，尤其在XDR-MTB中即使不存在inhA突變，常規給患者加用PTH可能無效。

本研究仍存在一定的局限和不足之處。首先，本研究是臨床數據的總結，實驗室只是報告有無katG突變和inhA突變，沒有具體突變位點的描述，所以沒能對katG和inhA突變位點及inhA基因調控區或編碼區突變具體描述。熔解曲線法試劑盒是對INH耐藥檢測位點包括inhA94、inhA啟動子區-17～-8位點突變、katG315密碼子檢測，研究數據katG315突變均和INH高度耐藥相關，inhA突變以啟動子區突變為主，并且這一啟動子和編碼區突變均可導致對INH的低度耐藥[3]，并且均與對PTH的耐藥相關。所以，雖然沒有對具體位點進行描述，但是不影響檢測結果臨床意義的判斷。第二，研究對象數量有限，且均來自筆者醫院，而筆者所在醫院多收治以北方為主的、全國的難治性結核病患者，就診患者中耐藥患者較多，所以數據結果可能有偏倚。

綜上所述，本次研究結果顯示MDR-MTB和XDR-MTB菌株對INH耐藥相關的基因突變均是以katG突變為主；從MDR-MTB到XDR-MTB，inhA單突變率降低。所以，在XDR-TB中常規治療方案加用高劑量INH可能使患者受益很小。從MDR-MTB到 XDR-MTB菌株中，對PTH耐藥率明顯增加，inhA基因突變率下降，未檢測到inhA突變的菌株并不一定對PTH敏感，尤其是在XDR-MTB中，inhA突變可能不是菌株對PTH耐藥的主要原因，建議完善其他分子檢測或者藥敏試驗，制定個體化的治療方案。