肺結核并發糖尿病患者血漿氧化應激水平的檢測結果分析

李春玲 牛良飛 李海聰 吳康 盧水華 范小勇

肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)是結核病中最常見的類型，也是威脅人類健康的主要傳染性疾病之一。據統計，全球約15% 的結核病患者并發有糖尿病(diabetes mellitus, DM)，且這個比率在未來的幾十年里可能會繼續增加[1]。結核感染病灶及血液循環系統中均存在著一定的氧化環境[2]，在正常情況下機體內氧化物的生成與抗氧化物的清除能力處于動態平衡之中，但當機體內產生過多的氧化物質超出其抗氧化能力，則引起氧化與抗氧化失衡狀態(稱之為氧化應激)[3]。并發糖尿病可加重結核病進展的風險，包括其治愈率降低、死亡率升高、耐藥突變增加等[4]，但是否與氧化物的過量生成有關，相關研究還不多。本研究通過定量檢測PTB患者、肺結核并發2型糖尿病(PTB-DM2)患者，及健康對照志愿者血漿中氧化物的水平，探討PTB-DM2患者血漿氧化應激水平的變化。

材料和方法

1. 研究對象：納入2016年2月至2017年1月上海市公共衛生臨床中心收治的45例初治肺結核患者(PTB組)與28例肺結核并發2型糖尿病患者(PTB-DM2組)，2組患者按照年齡及治療時間匹配入組；另納入24名在我中心體檢的無結核病和糖尿病癥狀及相關病史、無結核病密切接觸史的健康志愿者作為對照組(HC組)。所有入組者除外并發腫瘤、HIV 感染或AIDS、病毒性肝炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病、內分泌功能失調及其他細菌感染者。本研究通過了上海市公共衛生臨床中心倫理委員會審核，入組者均知情同意并簽署知情同意書。入組者基本信息見表1。PTB組及PTB-DM2組患者的相關實驗室檢查指標見表2。

2.疾病診斷標準：PTB的診斷標準參照中華人民共和國2017發布的《WS 288—2017 肺結核診斷》[5]，糖尿病的診療參照2017版《中國2型糖尿病防治指南》[6]。

表1 基本信息在三組患者中的分布情況

注a：年齡以中位數(四分位數)[M(P25，P75)]進行描述；統計值是三組數值的比較，方法是行×列卡方檢驗；b：存在理論頻數小于1數據，采用Fisher確切概率法

表2 實驗室異常指標在PTB組與PTB-DM2組的分布

注 表中括號外數值為“患者例數”，括號內數值為“發生率(%)”；“-”：理論頻數小于1，采用Fisher確切概率法

3.檢測指標及方法：用肝素抗凝管采集所有受試者的晨起空腹靜脈血，800×g離心10 min分離血漿后置于-80 ℃備用。總抗氧化能力(total anti-oxidant capacity，T-AOC)檢測采用鐵離子被還原成亞鐵離子后與菲啉類物質絡合的顯色比色法，結果以U/ml表示；過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測采用乙酸-重鉻酸鉀與過氧化氫反應的顯色比色法，結果用U/ml表示；血紅素氧合酶-1(heme oxygena-se 1, HO-1)檢測采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，結果以ng/ml表示；還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)檢測采用酶標法，利用5,5′-二硫基-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)循環反應檢測血漿中GSH的含量，結果以μmol/ml表示；超氧化物歧化酶(superoxide dismutae, SOD)檢測采用水溶性四唑鹽試劑(WST-1)法，結果以U/ml表示；丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測采用硫代巴比妥酸反應產物比色法，結果以nmol/ml表示。所有檢測試劑均采購自南京建成生物工程技術有限公司，檢測方法均嚴格參照說明書進行。

4.統計學處理：所有數據均采用SPSS 23.0軟件進行分析，文中數據經Kolmogorov-SmirnovZ檢驗不符合正態分布，故計量資料使用“中位數(四分位數)[M(P25，P75)]”表示，假設檢驗方法采用非參數檢驗(秩和檢驗)，兩個獨立樣本采用非參數檢驗(即Kruskal-WallisZ檢驗)，三組數值的比較，采用行×列卡方檢驗；率的比較采用χ2檢驗；理論頻數小于1時采用Fisher確切概率法。均以P<0.05為差異有統計學意義。文中點圖采用GraphPad Prism 7.0 軟件制作。

結 果

結果顯示，3組人群血漿中的T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD等抗氧化物的含量及MDA水平差異均有統計學意義(P值均<0.05)，詳見表3。PTB組患者血漿的T-AOC、CAT、HO-1含量較HC組均明顯下降，MDA水平較HC組明顯升高，差異均有統計學意義(Z=-3.88，P<0.01;Z=-3.82，P<0.01；Z=-3.21，P=0.005；Z=-3.94，P=0.008)；GSH、SOD水平PTB組與HC組間差異均無統計學意義(Z=-1.27，P=0.203；Z=-0.83，P=0.406)。PTB-DM2組患者的T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD水平較PTB組患者均明顯下降，MDA水平較PTB組患者明顯升高，差異均有統計學意義(Z=-3.08，P=0.047；Z=-2.44，P=0.046；Z=-2.27，P=0.023；Z=-2.45，P=0.096；Z=-3.50，P=0.002；Z=-6.01，P<0.01)。3組各指標差異點狀展示見圖1～6。

討 論

近年來，隨著慢性炎癥性疾病的高發，氧化應激與慢性炎癥性疾病的研究得以廣泛開展[7-8]。正常情況下，機體內產生的氧化物可很快被抗氧化系統清除，氧化物的生成與抗氧化物的清除能力處于動態平衡之中。結核分枝桿菌是一種專性需氧的胞內寄生菌，主要在宿主的巨噬細胞內生長增殖。當吞噬細胞吞噬入侵的結核分枝桿菌之后，機體在殺死病原菌的過程中會產生大量的自由基，其中羥自由基等氧化能力較強，易造成細胞及組織損傷。機體一方面需要消耗更多的抗氧化物質來維持自身氧化平衡，另一方面這些過量的自由基可通過與巰基(-SH)結合使含巰基的抗氧化劑失活，加之PTB患者自身營養狀況不良，大多缺乏維生素C、維生素E等抗氧化物質[9-10]，極易導致PTB患者體內氧化物過多，抗氧化物質減少，氧化和抗氧化平衡狀態被打破。PTB-DM2患者的長期高血糖可加重機體的氧化應激水平，進而反作用于患病機體使病情加重。目前，常用的檢測血液氧化應激水平的保護性指標有T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD，氧化脂質損傷的指標為MDA。T-AOC是機體對抗氧化能力的總體反應；CAT具有清除體內H2O2的功能，在抗氧化過程中具有重要作用[11]；HO-1是一種誘導型胞內酶，廣泛存在于多種細胞及組織中，是一種氧化應激的拮抗劑[12]；GSH是一種水溶性的抗氧化物，其活性巰基結構是重要的功能基團；SOD是能通過歧化反應將超氧化物轉化為過氧化氫和氧氣的一種酶，是機體強有力的抗氧化劑和自由基清除劑，在保護機體免受脂質、蛋白質及DNA損傷過程中起著重要的作用；MDA是脂質過氧化的主要代謝產物，其含量的高低可反映機體細胞受自由基攻擊脂質過氧化的程度。

表3 氧化應激狀態指標在不同組中的檢測結果比較

注 表中計量資料不符合正態分布，使用“中位數(四分位數)[M(P25，P75)]”表示，三組數值比較采用行×列卡方檢驗

圖1～6 不同人群血漿中T-AOC、CAT、HO-1、GSH、SOD與MDA的檢測結果。其中HC為健康志愿者，PTB為肺結核患者，PTB-DM2 為肺結核并發2型糖尿病患者。圖1～3 分別可見PTB組的T-AOC、CAT、HO-1水平均低于HC組，高于PTB-DM2組。圖4、5 可見PTB組的GSH、SOD水平均低于HC組，但差異均無統計學意義；但高于PTB-DM2組。圖6 可見PTB組的MDA水平高于HC組，低于PTB-DM2組

本研究發現，PTB患者血漿中T-AOC、CAT及HO-1水平均明顯低于HC組，提示機體感染結核分枝桿菌后，處于氧化與抗氧化失衡狀態且存在脂質氧化損傷加重。有研究結果顯示，與健康對照組相比，PTB組血清氧化物及脂質損傷標志物MDA含量均較高，致總抗氧化能力顯著降低[13]。與本實驗的研究結果一致。

本研究還發現，與單純PTB患者相比，PTB-DM2患者的氧化應激狀態更加惡化，T-AOC和其他抗氧化物水平均明顯降低。提示PTB并發糖尿病后，可加劇患者機體內氧化和抗氧化失衡，機體的氧化損傷更為嚴重，可能與糖尿病患者胰島素功能不全及高血糖誘發相關。有研究認為，糖尿病引發的高血糖是誘發機體產生大量活性氧(ROS)及活性氮(RNS)的主要原因，過多糖代謝產物也是加重氧化物與抗氧化系統失衡的重要因素。研究表明，胰島素具有抗氧化的作用，其可以通過胰島素信號通路調節各種抗氧化酶及關鍵轉錄因子的相互作用，其中包括核因子紅細胞相關因子2(Nrf2)和核因子κB(NF-κB)，致ROS產生減少并促進ROS消除[14]。而2型糖尿病患者多為胰島素抵抗伴胰島素相對缺乏，即糖尿病患者體內的胰島素正常功能受損，調節血糖的能力降低，可能也導致抗氧化的作用受到損傷。另外，氧化應激不僅可以破壞胰島β細胞，抑制胰島素的合成與分泌，還可誘導胰島素抵抗的發生，誘發或加重糖尿病病情[1]。因此，處于氧化應激狀態的結核病患者更易并發糖尿病，而糖尿病本身與氧化應激的相互拮抗將加重結核病患者體內的氧化和抗氧化動態失衡，并使其治療效果及預后變差[15]。本研究結果表明，PTB-DM2患者的抗氧化能力降低，脂質損傷加重。

綜上所述，本研究證明了PTB患者體內存在抗氧化能力的降低及脂質損傷，發現了并發2型糖尿病可以加重PTB患者的氧化應激水平及脂質氧化損傷。因此，改善機體的氧化應激狀態，可能為結核病及耐藥結核病的輔助治療提供新思路。但是，由于氧化應激指標水平所受的影響因素較多[16]，需要進一步優化氧化應激生化指標的檢測，加強對PTB或PTB-DM2患者的輔助診斷及預后的監測。