在昆蟲細胞中表達西尼羅河病毒prM+E蛋白

劉成倩,李 紅,陳 斌,易建中

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海201106）

西尼河病毒（West Nile virus,WNV）為單鏈正股RNA病毒,屬于日本腦炎血清群,可引起人、馬及鳥類等多種動物發病,表現為高燒、惡心、四肢酸痛等類似感冒的癥狀,有的表現為腦炎和腦膜炎等嚴重癥狀,在非洲、歐洲、亞洲、大洋洲和美洲的多個國家和地區都有病例發生[1]。目前,我國還沒有關于發現西尼羅河病毒的報道,但我國是日本乙型腦炎的疫區,所以加強防控很有必要,特別是建立一種特異性好的檢測方法更是意義重大。在諸多血清學檢測方法中,MAC-ELISA往往能給出最早的結論[2]。有研究顯示,同時表達WNV的前膜蛋白（Rremembrine protein,prM）和E蛋白可以形成病毒樣顆粒（VLR）,可為MACELISA方法的應用提供抗原[3]。

以往研究大多是利用真核表達載體獲得西尼羅河病毒樣顆粒,但普遍存在表達不穩定的現象。目前,利用桿狀病毒表達系統生產西尼羅河病毒樣顆粒的研究還沒有報道。作為蟲媒病毒,西尼羅河病毒對昆蟲細胞有著天然的嗜性,昆蟲細胞中具備形成WNV VLR的一些條件,而prM和E蛋白的表達是獲得WNV VLR的先決條件。本試驗利用桿狀病毒表達系統構建包含西尼羅河病毒prM+E基因的重組桿狀病毒,之后感染昆蟲細胞sf9,以期能利用表達得到的單個蛋白或者VLR作為建立MAC-ELISA方法的抗原。

1 材料與方法

1.1 基因、菌種及試劑

質粒pFast-Bac1、感受態細胞DH10-Bac和昆蟲細胞sf9均由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所病毒課題組提供。prM∕E基因參照西尼羅河NY 99基因序列分段合成。

Taq酶及內切酶EcoRⅠ、PstⅠ和T4 DNA連接酶均購自上海皓嘉科技發展有限公司;Western-Blot顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;KOD-Rlus購自東洋紡公司。

WNV滅活疫苗兔多克隆抗體為南京市檢驗檢疫局動檢部門饋贈。

1.2 引物的設計與合成

為了后續試驗的需求,在設計擴增prM∕E基因的上游引物時引入EcoRⅠ酶切位點及偏好昆蟲細胞密碼子的3個氨基酸和His標簽,下游引物引入PstⅠ酶切位點及His標簽序列。引物序列WNV-RE-F:GTGGAATTCATGTCGTACTAC CATCACCATCACCATCACGGAGGAAAGACCGGAATTGC,斜體是酶切位點EcoRⅠ,下劃線部分為偏好昆蟲細胞密碼子的3個氨基酸,加粗為His標簽序列;WNV-RE-R:GCAACTGCAGTTAATGATGGTGGTGATGATGAGCGTGCACGTTCACGGAGAGG,斜體是酶切位點PstI,加粗是His標簽序列。

設計1對位于桿狀病毒上的引物M13-F∕R用于篩選重組桿狀病毒Bacmid,及后期檢測引物WNV-F∕R。引物序列M13-F:GTTTTCCCAGTCACGAC;M13-R:CAGGAAACAGCTATGAC;WNV-F:GCACGAATTCGGAGGAAAGACCGGAATT;WNV-R:AGATCTCGAGAGCGTGCACGTTCACGGA。

上述引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

1.3 目的基因的擴增

RCR 反應體系 50 μL:10 倍稀釋的質粒模板 1 μL,10 × Buffer（Mg2+free）5 μL,MgSO44 μL,dNTR（2 mmol∕L）5 μL,WNV-RE-F∕R（10 μmol∕L） 各 1.5 μL,KOD-Rlus 酶 2 μL,ddH2O 31 μL;在冰上混合。RCR反應條件:94℃ 5 min;94℃ 45 s,58℃ 30 s,68℃ 2 min,循環35次;最后68℃ 延伸10 min。

1.4 WNV prM+E基因重組pFast-Bac1的構建

利用限制性內切酶EcoRⅠ和PstⅠ分別對prM+E基因RCR產物和pFast-Bac1供體質粒進行酶切,將純化回收后的RCR產物與pFast-Bac1供體質粒連接,連接物轉化大腸桿菌TOR10。將菌落RCR和酶切鑒定為陽性的質粒送往上海華大基因科技股份有限公司測序,測序正確的質粒命名為Rfast-Bac1-W-RE。

1.5 重組桿狀病毒Bacmid的構建

將pFast-Bac1-W-RE轉化感受態細胞DH10-Bac。取50 μL 1∶100稀釋的菌液涂布于含有慶大霉素、四環素、卡那霉素、IRTG、X-gal的LB平板上,置于37℃培養箱培養48 h以上,有藍白斑出現的時候,在超凈臺內挑取白色單菌落在新的含有以上5種試劑的LB平板上劃線,繼續培養48 h,直到劃線的菌落全部都為白色,用引物M13-F∕R進行重組菌的鑒定,將鑒定正確的菌落進行質粒抽提。

1.6 重組桿狀病毒質粒轉染昆蟲細胞sf9

取出一瓶生長狀態良好的sf9細胞,將約9×105個細胞接種于6孔板中,加入2 mL SF900-Ⅱ無血清培養基,置于27℃培養箱中使細胞貼壁1 h。將質粒pFast-Bac1-W-RE及轉染試劑LipofectamineTM2000按比例稀釋,之后按轉染試劑說明書進行轉染。每個質粒樣品設3個復孔。24 h后觀察細胞形態,培養96 h后收集細胞上清液,低速離心后分裝上清液備用。此為1代病毒液。

1.7 病毒液的擴增

接種細胞的方法同1.6,置于27℃培養箱中過夜,待每個孔內貼壁細胞細胞長至90%—95%,棄掉舊培養基,每孔加入100 μL一代病毒液,補足新鮮的培養基至2 mL。繼續培養,每天觀察一次。當細胞出現病變時收集病毒液,細胞病變一般表現為:細胞膨大,有的出現裂解。

1.8 感染進程及目的基因表達的轉錄水平檢測

將sf9細胞接種到24孔板中,27℃培養過夜。每個樣品重復一孔,每孔加入50 μL病毒液,并留一對孔作為陰性對照。27℃培養2 h后,用RBS 300 μL∕孔洗滌4次;最后加入400 μL培養基,置于27℃培養箱中繼續培養。

用ER管每天收集一對孔的上清液和細胞裂解液,連續收集7 d,對照孔于第4天收集,-70℃保存備用。待所有孔收集之后,用少量病毒RNA∕DNA提取試劑盒提取上清中桿狀病毒的DNA,用于RCR檢測,所用引物為 WNV-F∕R。

按照Trizol試劑說明書提取細胞中的總RNA,用于RT-RCR擴增。反轉錄體系:3 μL病毒 RNA,1 μL dNTR Mixture（10 mmol∕L）,WNV-R 1 μL（10 μmol∕L）,在冰上混合后 65 ℃ 5 min,冰上急冷 2 min。繼續加入 2 μL 5 × RrimeScript Reverse transcriptase Buffer,0.5 μL RNase 抑制劑,0.5 μL RrimeScript Reverse Tanscriptase（5 U∕μL）,2 μL DERC處理水。在冰上混合后,42℃ 1 h后再75℃處理5 min。

RCR 反應體系:反轉錄模板3 μL,10 ×RCR buffer 5 μL,dNTR（10 mmol∕L）1 μL,WNV-F∕R（10 μmol∕L）各1 μL,Taq酶0.5 μL,最后加入 ddH2O至總體積50 μL;RCR反應條件:95℃ 5 min;94℃ 45 s,60℃30 s,72℃ 2 min,35個循環;72℃再延伸10 min。取RCR產物6 μL在1.0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳。

1.9 目的基因表達的蛋白水平檢測

將每孔約1×106個sf9細胞接種在6孔板中,27℃培養至貼壁,感染病毒液,并設1個對照孔。27℃培養,每隔2 d收集1孔的上清液和細胞裂解液,對照孔于感染后第4天收集。

細胞裂解液用超濾濃縮管濃縮,所用的截留分子量為10 ku,之后分裝10 μL∕管,-70℃保存備用。

1.10 Western-Blot檢測

將1.9中細胞裂解液進行SDS-RAGE電泳,按半干轉移法轉RVDF膜。以WNV兔多抗為一抗孵育1.5 h,二抗用HRR標記的山羊抗兔IgG孵育1 h,用RBST洗后在暗室內曝光顯影。

2 結果與分析

2.1 目的條帶擴增

prM+E基因片段和引物中含有的His標簽序列及酶切位點共2121 bp,與RCR產物結果相符（圖1）,表明已獲得目的基因片段。

2.2 重組質粒Pfast-Bac1-W-PE的篩選

用內切酶EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切prM+E基因RCR產物和Rfast-Bac1質粒,連接轉化涂板后挑取4個菌落進行RCR鑒定,擴增片段大小與預期結果一致（圖2）,說明已篩選出Rfast-Bac1-W-RE陽性重組菌落。

圖1 WNV prM+E基因片段的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of WNV prM+E gene

圖2 Pfast-Bac1-W-PE菌落PCR篩選Fig.2 Screening of Pfast-Bac1-W-PE recombinants by PCR

初步鑒定為陽性的菌落提取質粒,用EcoRⅠ和 PstⅠ雙酶切后,出現一條2121 bp的片段（圖3）,與prM+E基因片段大小相符,說明重組質粒 Rfast-Bac1-W-RE構建成功。

2.3 重組桿狀病毒的篩選

質粒Rfast-Bac1-W-RE轉化感受態細胞DH10-Bac,之后涂布于含有三抗和IRTG、X-gal的LB平板進行篩選,挑取單菌落培養并進行RCR擴增。根據重組桿狀病毒質粒的結構示意圖（圖4）,用3對引物進行驗證。使用引物M13-F∕R擴增空桿菌質粒,所得片段長約300 bp,如果發生重組擴增片段長約4400 bp。用引物M13-F和WNVRE-R可以擴增出約3600 bp的片段,最后再用引物WNV-RE-F∕R驗證。電泳結果與預期大小一致,說明重組已經發生（圖5）。

圖4 重組桿狀病毒質粒結構示意圖Fig.4 Structure diagram of the recombined bacilli plasmid

圖3 Pfast-Bac1-W-PE重組質粒酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid Pfast-Bac1-W-PE by restriction enzyme digestion

圖5 重組桿狀病毒質粒的PCR鑒定結果Fig.5 PCR identification results of the recombinant bacilli plasmid

2.4 重組桿狀病毒轉染sf9細胞后的病變

細胞病變在感染第二代細胞中比較明顯,細胞感染2 d后停止生長,體積逐漸膨脹變大,7 d后出現脫壁和裂解。圖6a為正常的sf9細胞,細胞邊緣清晰透亮。圖6b為感染后細胞膨脹變大的照片,細胞邊緣模糊。圖6C為細胞裂解后的照片,很多細胞已經發生裂解,內容物外泄。

圖6 重組桿狀病毒感染sf9細胞Fig.6 The sf9 cells infected by recombined baculovirus

2.5 感染進程的檢測

接毒后每隔一天收集細胞上清液和細胞裂解液,連續收毒7次,之后提取培養基中的病毒DNA和細胞中的總RNA。病毒DNA檢測結果見圖7,可見泳道1—7在2000 bp處均有一條弱帶,陰性對照無。

利用RT-RCR檢測細胞裂解液中prM+E基因mRNA的轉錄情況（圖8）。泳道1—7均出現特異性條帶,在感染后24 h基因就已經被轉錄,感染后第5—6天最強。

2.6 目的基因表達的蛋白及Western-Blot檢測結果

在6孔板中感染的Sf9細胞,每隔48 h收集一個孔細胞,細胞裂解液SDS-RAGE電泳檢測結果見圖9。在43.0 ku與66.2 ku條帶之間,泳道1—4較泳道5多出一個條帶,從分子量上來判斷應該是51 ku的E蛋白,說明E蛋白已經得到表達。

圖7 重組桿狀病毒感染sf9細胞1—7 d病毒液檢測結果Fig.7 The virus solution detection results of Sf9 cells infected by recombinant baculovirus during 1—7 day

圖8 重組桿狀病毒感染sf9細胞1—7 d細胞裂解液檢測結果Fig.8 The cell lysate detection results of Sf9 cells infected by recombinant baculovirus during 1—7 day

Western-Blot檢測結果顯示（圖10）,表達的E蛋白可以與WNV兔多抗發生特異性反應,而對照孔則無。

圖9 感染細胞裂解液的SDS-PAGE檢測Fig.9 SDS-PAGE detection of the infected cell lysate

圖10 感染細胞裂解液的Western-Blot檢測Fig.10 Western-Blot detection of the infected cell lysate

3 討論

桿狀病毒表達系統具有相對穩定、篩選周期短、表達的蛋白折疊正確、表達量高、蛋白較容易分泌、純化方便等優點,所以本研究選用昆蟲細胞表達系統來表達西尼羅河病毒的相關蛋白以用于后續研究。

E蛋白是西尼羅河病毒的主要結構蛋白,國內外有學者已對其功能進行研究。結構域I主要構成E蛋白的基本骨架,結構域Ⅱ參與Ⅱ型細胞識別融合過程[4-6],結構域Ⅲ含有一個類免疫球蛋白的恒定區和受體結合區。史利軍等[7]表達了E蛋白的結構域Ⅲ,Western-Blot檢測結果表明結構域Ⅲ具有很強的穩定性。Oliphant等[8]為了研究E蛋白上的中和表位,選擇表達結構域I和II。prM蛋白是成熟病毒顆粒中的M蛋白的前體形式。prM蛋白有助于E蛋白在內質網膜上的定位及空間構象的形成,并能防止E蛋白在高爾基體囊泡中過早成熟[9]。

本試驗構建的prM+E重組桿狀病毒在感染后第2天蛋白就得到了較高的表達。用桿狀病毒表達系統來表達出完整的prM+E蛋白在國內外屬于首例。prM被切割成成熟的M蛋白之后分子量約為7 ku,由于分子量較小,可能被試驗中所用的平均截留分子量為10 ku的超濾濃縮管過濾掉,所以在Western-Blot結果中沒有檢測到prM蛋白的條帶,而只有E蛋白條帶;按理論prM基因讀框位于E蛋白前端,E蛋白得到了表達,prM蛋白肯定也得到了表達。接下來的研究需要驗證培養基上清中是否存在病毒樣顆粒,如果存在即可作為抗原用于MAC-ELISA等檢測方法的建立,為國內構建WNV血清學早期診斷方法奠定基礎。