過硫酸鹽降解土壤中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的研究

周佳欣,姚春霞?,孫明星,白 冰??,周昌艷??

（1上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海201403;2上海出入境檢驗檢疫局,上海200135）

氯霉素類抗生素是一類具有1-苯基-2-氨基-1-丙醇的二氯乙酰胺衍生物,又稱酰胺醇類,這類抗生素包括氯霉素（Chloramphenicol）及其衍生物甲砜霉素（Thiamphenicol）、氟甲砜霉素（Florfenicol）等（圖 1）。氯霉素作為廉價的廣譜抗生素,被廣泛用于人、畜多種傳染性疾病的治療[1]。研究發現氯霉素對人的造血系統、消化系統具有嚴重的毒性反應,長期微量攝入氯霉素可誘發致病菌的耐藥性,導致機體正常菌群失調,使人們易感染各種疾病。鑒于以上原因,很多國家和地區開始禁止或者嚴格限制使用氯霉素[2],中國也將其列入農業部《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》公告,規定在所有動物性產品中氯霉素不得檢出[3]。甲砜霉素和氟甲砜霉素屬氯霉素類藥物,廣泛用于治療豬、牛、禽及水產養殖動物的細菌性疾病,加之氯霉素被許多國家禁用,因而這兩種藥物成為目前水產養殖中最廣范使用的藥物之一。現除我國與日本外,歐共體和美國將甲砜霉素和氟甲砜霉素禁用于動物食品。目前很多國家都已制定關于甲砜霉素和氟甲砜霉素的最大殘留限量[4-6]。

圖1 氯霉素（a）、甲砜霉素（b）和氟甲砜霉素（c）化學結構式Fig.1 Chemical structure of chloramphenicol（a）,thiamphenicol（b）and florfenicol（c）

氯霉素類抗生素廣泛地應用于畜牧養殖和水產養殖業,一方面,抗生素藥物的不合理使用可能導致土壤中藥物殘留,以及畜禽抗生素蓄積中毒,對消費者健康構成威脅;另一方面,抗生素藥物會以原形化合物或代謝產物的方式從糞、尿等排泄物進入環境,這些藥物或代謝產物在環境中往往能維持很長時間的活性,對微生物、部分動植物產生不同程度的影響,造成土壤污染,給生態環境帶來負面影響[7-11]。

對于受氯霉素類抗生素污染的土壤,能夠采用的控制技術眾多,如微生物技術、膜處理技術、輻照技術等等[12-15],但存在著耗時長、需要場地大,有儀器和環境條件限制等問題,無法廣泛推廣。過硫酸鹽經過活化產生的硫酸根自由基有較強的氧化活性,被廣泛應用于處理毒性強的難降解有機污染物[16-20]。過硫酸鹽需經過活化才具有活性,熱活化法和UV活化法可對土壤進行處理,但是所需能源消耗量大、程序比較復雜,增加了處理的費用,難以實現大規模應用。而過渡金屬離子活化法在常溫常壓下進行,操作方式相對簡單,易于實現。因此,本研究對過硫酸鹽降解土壤中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素進行分析,確定最佳反應條件和參數,旨在提供一種高效、無二次污染、操作簡便的方法,降低土壤中氯霉素類抗生素殘留。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

樣品的采集:取農業用地土壤樣品1000 g,烘干后研磨,過100目篩（孔徑0.15 mm）,放入廣口瓶備用。

藥品與試劑:氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標準品（純度均≥98%,購自Sigma公司）,制備氯霉素類藥物儲備液10 mg∕L,儲存于棕色玻璃瓶中,-20℃下避光保存。過硫酸鉀、硫酸亞鐵、0.22 μm有機濾膜（中國安譜公司）。甲醇（色譜純,美國Merck公司）;乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、丙酮（色譜純,上海安譜公司）;實驗室用水為超純水。

主要儀器:液相色譜-串聯質譜儀（電噴霧離子源,美國Waters公司）、ACQUITY URLC BEH C18色譜柱（1.7 m,2.1 mm×100 mm）（美國 Waters公司）;HGC-24A氮吹儀（中國Hengao公司）;MX-F渦動混合器（中國Dragonlab公司）、5415D離心機（德國Eppendorf公司）;

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理

樣品提取:參照文獻[21-23],稱取2 g土壤樣品于50 mL具塞離心管中,加入磷酸鹽緩沖液,渦旋混合30 s后靜置15 min;加入氨化乙酸乙酯（乙酸乙酯∶25%氨水=98∶2,V∕V）渦旋混合30 s,超聲波提取10 min;以8000 r∕min離心5 min,轉移上層有機溶液于45℃水浴中旋轉蒸發至干,加入4 mL 4%氯化鈉溶液使之充分溶解,待凈化。

凈化:上述溶液用5 mL正己烷凈化脫脂,離心后棄去正己烷層;水層加入8 mL丙酮,離心后轉移上清液于50 mL具塞離心管中,加入10 mL二氯甲烷,渦旋30 s;以8000 r∕min離心5 min,轉移下層有機溶液于45℃水浴中旋轉蒸發至干,用1 mL甲醇-水（20∶80,V∕V）溶解殘留物,經0.45 μm濾膜過濾后上機測定。

1.2.2 儀器分析條件

色譜條件:流動相為甲醇:10 mmol∕L 醋酸銨水溶液（30∶70,V∕V）,含 0.1%冰醋酸,流速 0.2 mL∕min;柱溫25℃。ESI（-）MRM檢測。毛細管電壓1.5 kV;源溫度80℃;去溶劑溫度350℃;錐孔氣流30 L∕h,去溶劑氣流400 L∕h,碰撞氣體為氬氣,碰撞氣壓0.25 Ra。

質譜條件:采用電噴霧離子源（ESI）,負離子掃描,噴霧電壓2500 V,源內誘導解離電壓10 V,多反應監測（MRM）方式檢測,其他質譜條件見表1。

表1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素優化的質譜條件Table 1 The optimized MS-MS conditions for chloramphenicol,thiamphenicol and florfenicol

2 結果與分析

2.1 不同初始pH對降解率的影響

稱取經過粉碎混勻的黏土樣品2 g,外源添加氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素,含量為10 mg∕kg,加入0.1 mol∕L過硫酸鉀水溶液2 mL,加入0.1 mol∕L硫酸亞鐵溶液2 mL,將反應體系的初始pH分別調節為3、5、7、9、11,充分混勻,37℃靜置反應4 h,同時以未添加硫酸亞鐵和過硫酸鉀的空白樣品為對照,經液相色譜-質譜聯用儀檢測氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素濃度。圖2結果表明,在酸性條件下,氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素降解率較高。在pH為3的條件下,降解速度最快,當反應時間為1 h時,3種抗生素的降解率達到70%以上;當反應時間為2 h后,反應達到正向平衡。而在堿性條件下,降解率較低,且降解速度較慢。因此本研究選取初始pH為3作為試驗初始條件。

圖2 初始 pH 分別為3、5、7、9、11 時氯霉素（a）、甲砜霉素（b）、氟甲砜霉素（c）的降解效果Fig.2 Degradation of chloramphenicol（a）,thiamphenicol（b）and florfenicol（c）at different pH value（pH value=3,5,7,9 and 11）

2.2 不同金屬離子活化過硫酸鹽條件下的降解效果

根據參考文獻[18-19],過硫酸鹽可在金屬離子的過渡激發態條件下活化而產生硫酸根自由基,進而氧化有機物。已有文獻報道的金屬離子包括Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Co2+等等。結合金屬離子的安全性,本研究選取Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+作為活化離子,考察其對過硫酸鹽氧化作用的活化效果。

稱取經過粉碎混勻的黏土樣品2 g,外源添加氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素,含量為10 mg∕kg,加入0.1 mol∕L 過硫酸鉀水溶液 2 mL,加入 0.1 mol∕L FeSO4、CuSO4、MnSO4和 ZnSO4水溶液 2 mL,調節反應體系初始pH分別為3,充分混勻,37℃靜置反應4 h,同時以未添加金屬離子和過硫酸鉀的空白樣品為對照,經液相色譜-質譜聯用儀檢測氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素濃度。圖3結果表明,活化效果Cu2+最好,其次是Fe2+,Mn2+、Zn2+也有一定的活化效果,但是其產生的降解速度和降解率均低于Fe2+。由于Fe2+在土壤中天然存在,不會造成二次污染,且具有價格低廉、容易獲取等優點,在推廣使用方面具備優勢,因此本研究選擇Fe2+作為活化劑。

圖3 活化金屬離子為 Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+時氯霉素（a）、甲砜霉素（b）、氟甲砜霉素（c）的降解效果Fig.3 Degradation of chloramphenicol（a）,thiamphenicol（b）and florfenicol（c）at different transition metal ions（Fe2+,Cu2+,Mn2+and Zn2+）

2.3 不同亞鐵離子與過硫酸鹽的配比條件下的降解效果

對過硫酸鹽和Fe2+在實際應用中的投放比例進行優化。稱取經過粉碎混勻的黏土樣品2 g,外源添加氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素,含量為10 mg∕kg。基于以上兩項試驗結果,選取Fe2+作為活化金屬離子,調節試驗體系使pH為3。將過硫酸鉀與硫酸亞鐵溶液按照不同配比添加入反應體系,充分混勻,37℃靜置反應4 h,同時以未添加金屬離子和過硫酸鉀的空白樣品為對照,經液相色譜-質譜聯用儀檢測氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素濃度。

圖4結果表明,當過硫酸鉀∶Fe2+∶氯霉素類抗生素的摩爾質量比為40∶20∶1時,氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素降解率分別為80.9%,79.2%和78.4%,降解率較高。此后,提高過硫酸鉀∶Fe2+投入量,降解率沒有顯著增加。因此,推薦40∶20∶1的摩爾質量比為最佳的試驗投入比。

圖4 不同過硫酸鉀∶Fe2+∶氯霉素類抗生素的摩爾質量比條件下氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的降解效果Fig.4 Degradation of chloramphenicol,thiamphenicol and florfenicol at different ratios of persulfate∶Fe2+∶contaminants

3 討論與結論

該技術切實有效,已得到廣泛的應用。已有文獻報道,通過熱活化、UV活化、γ射線活化等方式激活過硫酸鹽,應用于水溶液中磺胺類抗生素、泰樂霉素等污染物的降解,可達到較高的降解率[16-20]。

本研究結果表明,S2O82-經Fe2+活化降解土壤中氯霉素類抗生素,可達到較高的降解率。經優化得到最佳反應參數:在酸性條件下的降解效果優于堿性條件,當pH為3時,降解率最高;過硫酸鉀∶Fe2+∶氯霉素類抗生素的摩爾質量比為40∶20∶1時,氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素降解率分別為80.9%,79.2%和78.4%,降解效果最佳。

本研究為亞鐵離子活化過硫酸鹽降解土壤中的抗生素提供一種新技術,該技術高效、安全、無二次污染、易操作,可安全應用于農業環境,為開發新型高效的土壤中抗生素處理技術及工藝提供技術支撐。