海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌群體遺傳結構分析

曹學仁, 車海彥, 羅大全

(中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所,農業部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室, ?？?571101)

天然橡膠是我國四大戰略物資之一。炭疽病是橡膠樹上的一種重要葉部病害,該病于1906年在斯里蘭卡被首次報道,目前在亞洲和非洲等橡膠種植國廣泛發生[1]。該病害早期在我國只在苗圃和新植幼樹上少量發現,自1962年首次在海南大豐農場開割膠樹上發現后,各植膠區陸續有其發生危害的報道[2-3]。近年來炭疽病的發生日趨嚴重,是農業部橡膠樹“兩病”春防工作的防治對象之一。

一直以來膠孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPenz.被認為是引起我國橡膠炭疽病的病原菌[4-5]。2010年李繼鋒等報道引起海南橡膠炭疽病的病原菌除膠孢炭疽菌外,還包括尖孢炭疽菌C.acutatumSimmonds[6]。隨著分子系統學的發展,發現C.gloeosporioides和C.acutatum均是復合種[7-8]。作者通過研究發現,目前海南橡膠樹炭疽病病原以C.gloeosporioides復合種為主[9]。通過分子系統學研究進一步表明,暹羅刺盤孢菌C.siamense是C.gloeosporioides復合種中的優勢種。目前關于橡膠樹炭疽菌的研究主要集中在復合種及種的鑒定方面[5-6,10],尚未見關于其種內的遺傳多樣性的研究報道。因此本研究對海南省橡膠樹C.siamense群體的遺傳結構、群體遺傳多樣性及單倍型地理分布進行了研究,從而為制定可持續控制該病害策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2017年4-8月,從海南保亭、儋州、?？凇偤：屯筒?個市縣的橡膠種植園中隨機采集炭疽病病葉,室內進行病原菌的分離和純化,經形態和多基因分子鑒定,確定為暹羅刺盤孢菌C.siamense的菌株58個,具體分布為:保亭12個、儋州10個、海口12個、瓊海15個和屯昌9個。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取

用滅菌的牙簽將在PDA平板上培養7 d的菌絲刮下,采用TIANGEN新型植物基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取病原菌DNA,提取方法參見試劑盒說明書。

1.2.2 PCR擴增

采用真菌核糖體內轉錄間隔區(ITS)通用引物ITS1和ITS4擴增ITS1、ITS2和5.8S rDNA全序列及18S rDNA和 28S rDNA的部分序列。PCR反應體系(25 μL):12.5 μL TaKaRa PremixTaq,引物各1 μL(5 μmol/L),模板DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件:95℃變性4 min;95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35個循環;72℃延伸7 min;4℃保存。

1.2.3 測序

PCR產物分別用正反向引物進行雙向測序,以保證測序的準確率。測序委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2.4 數據分析

原始雙向序列,采用DNAstar中Seqman拼接序列。應用MEGA version 6.0[11]對拼接序列進行比對分析。利用DnaSP 5.0[12]計算多基因片段組合序列的標準多樣性指數,如單倍型數H(number of haplotypes)、單倍型多樣性Hd(haplotype diversity)、核苷酸多樣性Pi(nucleotide diversity),并進行Tajima’sD中性檢驗,以及繪制核酸錯配分布圖(mismatch distribution of nucleotide)等。使用TCS1.21[13]構建暹羅刺盤孢菌單倍型的網絡圖。采用Arlequin 3.5.2.2[14]軟件進行分子變異分析(analysis of molecular variance, AMOVA)。采用MEGA 6.0構建系統發育樹,使用 Kimura 雙參數模型,構建分子系統發育樹(N-J tree),利用自展法(bootstrap,1 000 次重復)檢驗各分支的置信度。

2 結果與分析

2.1 海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌單倍型地理分布及其多樣性

利用ITS通用引物ITS1/ITS4對海南58個橡膠樹暹羅刺盤孢菌C.siamense擴增、測序、拼接和序列比對后,得到的ITS序列長度為591 bp,核苷酸組成分析結果表明:堿基A、T、G、C的平均含量分別為24.10%、24.24%、26.47%和25.2%,A+T含量為48.34%,G+C含量為51.66%。共發現多態性位點10個,其中簡約信息位點8個,單堿基變異位點2個。58條ITS序列共檢測到11種單倍型(haplotype,H)(表1),其中單倍型H11包含樣品數最多，達16個,且在5個市(縣)均有分布,其次為單倍型H4,有12個樣品在4個市(縣)有分布,說明各地理種群間存在頻繁的基因交流。從地區來看,?？趩伪缎妥疃?為7種;瓊海最少,為4種;保亭、儋州和屯昌分別有5種、6種和5種。保亭和儋州有自己獨特的單倍型,其中保亭獨特的單倍型有2種,說明各地區的病原菌存在一定的遺傳分化現象。

海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌不同地理種群的單倍型多樣性在0.724～0.889之間,其中儋州種群的單倍型多樣性最高,為0.889;瓊海種群的單倍型多樣性最低,為0.724。核苷酸多樣性(Pi)也處于較高的水平,在0.002 55～0.003 77之間(表1),結果表明,海南地區橡膠樹暹羅刺盤孢菌具有豐富的遺傳多樣性。

表1海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌樣品的分布及單倍型多樣性

Table1DistributionsandhaplotypediversityofColletotrichumsiamensesamplesfromrubbertreeinHainan

地區Site樣品數Number單倍型(數量)Haplotype (Number)單倍型多樣性Haplotype diversity核苷酸多樣性Nucleotide diversity保亭 Baoting12H1(4);H3(3);H7(1);H9(1);H11(3)0.8180.002 93儋州 Danzhou10H2(3);H4(2);H5(2);H6(1);H8(1);H11(1)0.8890.003 77?？?Haikou12H1(1);H2(1);H3(1);H4(4);H6(1);H10(1);H11(3)0.8640.003 60瓊海 Qionghai15H4(2);H5(4);H6(2);H11(7)0.7240.002 55屯昌 Tunchang9H1(1);H2(1);H4(4);H10(1);H11(2)0.8060.003 30合計 Total58H1(6);H2(5);H3(4);H4(12);H5(6);H6(4);H7(1);H8(1);H9(1);H10(2);H11(16)0.8550.003 45

2.2 單倍型網絡分析及種群擴張分析

利用TCS軟件繪制單倍型網絡結構圖(見圖1),可以看出病原菌發生了一定的遺傳分化,各單倍型并沒有依采樣地點形成各自的分支,而是呈現一個非典型星狀的發散圖。單倍型H11處于輻射中心,推測為原始單倍型。此外,由核苷酸不配對分布圖(圖2)可以看出,分布曲線呈雙峰形式。另外Tajima’s D中性檢驗結果為-0.164 55,無顯著性,這些結果均表明海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌種群歷史上未經歷明顯的擴張,其種群大小整體保持穩定。

圖1 海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌單倍型網絡圖Fig.1 Parsimony network of the haplotypes of Colletotrichum siamense from rubber tree in Hainan

2.3 遺傳分化分析

58個菌株ITS序列數據的AMOVA分析結果表明,海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌種群變異主要發生在種群內,占總變異的93.9%;而群體間遺傳差異較小,占總變異的6.1%,說明病菌群體間基因交流頻繁。種群內的遺傳分化指數(Fst)值為0.061,說明海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌群體產生了遺傳分化,這和單倍型的簡約網絡圖分析結果一致。

圖2 海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌群體核苷酸不配對分布Fig.2 Mismatch distribution of Colletotrichum siamense from rubber tree in Hainan

不同地理種群間的遺傳分化Fst見表3。保亭病菌樣品與其他四市(縣)之間的遺傳分化較大,Fst在0.215 74～0.324 8之間;瓊海病菌樣品與除保亭外的其他三市(縣)之間的Fst都小于0.05,說明這些群體間遺傳分化很弱,基因交流十分頻繁;?？谂c儋州、?？谂c屯昌之間的Fst均小于0.1,表明這些種群間存在一定程度的遺傳分化。

表2海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌種群內和種群間的分子變異分析

Table2AMOVAanalysisofgeneticvariationwithinandamongpopulationsofColletotrichumsiamensefromrubbertreeinHainan

變異來源Source自由度df平方和Sum of squares變異成分Variance components總變異百分比/%Percentage of variation統計Stat數值Value概率Prob群體間 Among populations42.8400.026 39 Va6.1群體內 Within populations5321.5390.406 39 Vb93.9Fst0.0610.023合計 Total5724.3790.432 78

表3海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌不同地理種群間遺傳分化值

Table3PairwiseFstvaluebetweengeographicalpopulationofColletotrichumsiamensefromrubbertreeinHainan

群體Population保亭Baoting儋州Danzhou?？贖aikou瓊海Qionghai屯昌Tunchang保亭Baoting0 儋州Danzhou0.260 090 ?？贖aikou0.215 74-0.064 270 瓊海Qionghai0.324 80-0.042 59-0.035 150 屯昌Tunchang0.317 12-0.065 51-0.083 01-0.023 620

2.4 基于 ITS 序列的系統發育關系分析

系統發育分析結果表明,來自同一地區的單倍型并沒有聚在一個分支內,而是分布在系統樹的不同分支中,不同地區菌株的單倍型交叉共存,說明其間存在有效的基因流,沒有呈現出明顯的地理差異,部分地理種群雖然具有獨特的單倍型,但各單倍型的差異不大。

圖3 采用鄰接法構建的基于ITS序列的海南橡膠樹 暹羅刺盤孢菌系統樹Fig.3 Neighbour-joining tree based on ITS sequences of Colletotrichum siamense from rubber tree in Hainan

3 討論

遺傳多樣性是評價一個物種的進化潛能和抵御自然界各種生存壓力的重要遺傳學指標。核糖體DNA內轉錄間隔區ITS(internal transcribed spacer)承受的選擇壓力較小,進化速率快,能提供比較豐富的核苷酸變異位點和信息位點,已經證實可用于研究真菌種內遺傳多樣性和群體遺傳結構,如李河等[15]利用ITS 序列對引起油茶炭疽病的膠孢炭疽菌種群的遺傳結構進行了研究,朱丹雪等[16]利用ITS 序列研究了果生刺盤孢菌C.fructicola的群體遺傳結構。本研究利用 ITS 序列,分析了海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌的種群遺傳結構,結果發現該病菌單倍型多樣性較豐富,病菌種群歷史上并沒有發生顯著的種群擴張,來自同一個地區病菌的單倍型未能聚在一起,這與海南省油茶及其他寄主植物果生刺盤孢菌群體和暹羅炭疽菌群體遺傳結構分析的結果一致[17-18]。

11種單倍型中,除了3種單倍型由于只有一個樣品而僅在一個市(縣)分布外,其余8種單倍型都在2個或2個以上市(縣)有分布,說明病菌在各地理種群間存在頻繁的基因交流。而遺傳分化指數結果說明海南橡膠樹暹羅刺盤孢菌群體產生了一定的遺傳分化,其中以保亭病菌樣品與其他四市(縣)之間的遺傳分化較大,這可能與保亭位于海南省南部,有五指山山脈與其他4市(縣)隔離,環境氣候條件與其他市(縣)區別較大。另外暹羅炭疽菌最早在泰國的咖啡漿果上發現[19],隨后在草莓、油茶、可可、番木瓜、辣椒、葡萄等多種寄主植物上均有發現[8],而有研究發現不同寄主種群間的暹羅炭疽菌有一定的遺傳分化[18],而海南不同地區作物種植存在一定差異,病菌為了適應寄主而產生變異,從而導致病菌具有豐富的遺傳多樣性。