木霉融合子Tpf-2的定殖及其對番茄防御酶系的影響

李紀順, 陳 凱, 李 玲, 趙忠娟, 楊玉忠, 楊合同

(齊魯工業大學(山東省科學院),山東省科學院生態研究所, 山東省應用微生物重點實驗室, 濟南 250103)

番茄猝倒病(tomato damping-off)是番茄苗期重要的毀滅性病害,多發生在苗床前期,感病幼苗易倒伏死亡,造成約60%的減產[1-2]。病原菌為卵菌門鞭毛菌亞門中的腐霉屬Pythiumspp.低等真菌,常以卵孢子生存繁殖,可在土中、水中腐生或寄生存活較長一段時間[3-4]。防治番茄猝倒病的主要方法是采用化學殺菌劑,但由于過量和不合理使用化學農藥防治病害帶來的一系列健康和環境問題,安全的生物防治越來越受到重視和應用[5-7]。

目前防治番茄猝倒病的生防菌種類主要包括芽胞桿菌和木霉[8-10],木霉因生長速度快、產孢能力強、分布廣泛、并具有細胞壁降解酶活性和代謝產生大量的抗生性物質而得到廣泛關注,但由于自然來源的木霉菌株田間應用效果不夠理想,制約了其進一步推廣應用[11-13]。利用現代生物技術對菌株進行改良選育,是獲得高效多功能生防菌株的有效手段[14-15]。本實驗室前期利用原生質體融合技術,選育得到1株木霉融合子Tpf-2,該融合子綜合生防性狀較好,溫室條件下對番茄猝倒病的防治效果達到85.0%以上,并可產生豐富的厚垣孢子[16]。厚垣孢子是木霉在逆境下產生的一種繁殖體,該類孢子在儲存、萌發及在逆境下的存活能力均遠遠優于分生孢子,田間應用時表現出較強的抗逆性[17],故以木霉融合子Tpf-2的厚垣孢子為有效成分制備微生物制劑進行病害防治,具有較好的應用前景。

木霉與植物的互作是一個復雜的過程,生防菌能否在靶標植物體內及其根際適應并定殖存活是篩選、評價土傳病害生防菌的重要指標[18],植物體內參與生理代謝過程多種防御反應酶與植物抵抗病原菌入侵也有密切關系[19-20]。本文以前期生防效果較好的木霉融合子Tpf-2為試驗菌株,重點研究接種病原菌瓜果腐霉P.aphanidermatum后,融合子Tpf-2在番茄根際土中的定殖動態,及對番茄葉片中相關防御酶的誘導活性,旨在探索供試菌株對番茄猝倒病的生防潛力及其與番茄植株誘導抗性的關系,進而為抗番茄猝倒病生防真菌的篩選及生防機理研究提供科學依據,為制劑改進和防效評價提供支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

供試菌株為木霉融合子Tpf-2,生防制劑為其厚垣孢子可濕性粉劑,有效成分含量為2億/g。病原真菌為瓜果腐霉P.aphanidermatumAcu36125,購自中國農業微生物菌種保藏管理中心,病原真菌在PDA平板上培養后,用無菌打孔器打取直徑5 mm的菌塊備用。番茄品種為日本‘京寶’,購自濟南大江種子有限公司。

1.2 試劑與儀器

Powersoil DNA Isolation Kit試劑盒,MoBio公司;Roche Light Cycler96熒光定量儀,羅氏診斷產品(上海)有限公司;TransStart Top Green qPCR SuperMix,Trans15K DNA Marker,北京全式金有限公司;DL2000 DNA Marker,TaKaRa公司;普析TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司。

1.3 溫室試驗

溫室試驗設4個處理:清水對照(CK)、瓜果腐霉P.aphanidermatum(Pa)、木霉融合子Tpf-2(Tpf-2)、木霉融合子Tpf-2+瓜果腐霉P.aphanidermatum(Tpf-2+Pa)。

試驗用土為大田健康土,番茄種子于25℃催芽至露白。播種時,CK處理組每盆放置10粒種子;Pa處理組每盆接入2塊瓜果腐霉菌塊,并放置10粒種子;Tpf-2處理組每盆放置10粒種子,種子上均勻撒入55 mg的Tpf-2制劑;Tpf-2+Pa處理組每盆接入2塊瓜果腐霉菌塊,并放置10粒種子,種子上均勻撒入55 mg的Tpf-2制劑。每個處理組種植21盆。

在人工氣候室內于光暗周期為10 h∥14 h,晝夜溫度為25℃∥18℃,空氣相對濕度為50%～70%的條件下,對盆栽樣品進行管理,各處理和對照分別于播種后15、30、45、60、90、120、150 d取樣檢測Tpf-2在番茄根際土中的定殖動態,并于播種后60 d取樣檢測番茄葉片相關防御酶活性,每次取樣設3個重復。

1.4 木霉融合子Tpf-2在番茄根際土中的定殖動態檢測

取樣時,將番茄根部小心地拔出,抖掉表層土,收集根際土,放入自封袋內帶回實驗室,土壤微生物基因組總DNA采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒進行提取,-20℃保存備用。

前期試驗表明,木霉融合子Tpf-2的Tef1區與已知木霉種類的Tef1區差異較大,同源性低于95.0%,本文以Tpf-2的Tef1區設計特異基因片段引物,Tef1F:5′-GTTTTCGTCACCCCGCTTCC-3′,Tef1R: 5′-GTGGCAGAGCAGGGCAAAAGA-3′,以微管蛋白β-tubulin基因為內參,基因片段引物為TubF:5′-GAAGATGTCGTCCACCTTTATT-3′,TubR:5′-GTGAACTCCATCTCGTCCAT-3′。以不同土壤DNA樣品為模板,首先利用常規PCR檢測引物的特異性,并通過qPCR檢測木霉融合子Tpf-2的定殖動態,每個樣品重復3次。

qPCR采用20 μL反應體系:2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL,10 μmol/L引物各0.4 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 8.2 μL。qPCR擴增條件:94℃預變性30 s;94℃變性5 s,60℃退火15 s,72℃延伸10 s,40個循環;按0.1℃/s升溫速率從65℃升至95℃,每升高0.5℃檢測1次熒光信號,進行熔解曲線分析。以木霉融合子Tpf-2處理組播種后150 d取樣樣品為標準樣品,利用2-ΔΔCt計算樣品中目的基因的相對定量結果[21],其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因,ΔΔCt=ΔCt試驗樣品-ΔCt標準樣品。

1.5 木霉融合子Tpf-2誘導番茄葉片防御酶活性檢測

番茄幼苗期是番茄發育的重要時期,這一階段子葉和真葉生長得好壞直接影響番茄進一步的生長發育,本試驗選取種植60 d的番茄葉片進行防御酶活性檢測,主要檢測超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD及過氧化氫酶CAT活性的變化[22-24],每個處理設3個重復。

酶活性計算:SOD活性單位以抑制氮藍四唑(NBT)光化還原50%所需酶量為1個酶活單位(U),SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(U·g-1);POD以每分鐘吸光度變化值(ΔA470)表示酶活力的大小(U·g-1·min-1);CAT以每分鐘吸光度變化值(ΔA240)表示酶活性大小(U·g-1·min-1)。

1.6 統計方法

用SPSS 19.0統計軟件中的鄧肯氏(Duncan’ s)方法對數據進行分析,結果為3次重復的平均值±標準差,以不同大寫字母表示在0.01水平上存在極顯著性差異,以不同小寫字母表示在0.05水平上存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 木霉融合子Tpf-2的定殖動態檢測

2.1.1 土樣DNA提取與檢測

利用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取土樣中的DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶,結果見圖1,不同處理,不同取樣時間采集的各土樣中均可提取到微生物總DNA。

圖1 土樣DNA電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram of soil DNA

2.1.2 引物特異性檢測

用設計的目的基因引物Tef1F/Tef1R及內參基因引物TubF/TubR對第一次取樣(15 d)的土樣DNA樣品進行PCR擴增,結果見圖2。用內參基因引物TubF/TubR擴增時,4個處理中均擴增出大小144 bp的條帶,說明所有土樣中均有真菌DNA的存在。用目的基因引物Tef1F/Tef1R擴增時,CK和Pa中未擴增到條帶,而Tpf-2和Tpf-2+Pa則擴增出大小159 bp的目的條帶,說明設計的目的基因引物具有特異性和高度準確性,可以利用該引物進行后續的定量分析檢測。

2.1.3 木霉融合子Tpf-2的定殖動態

利用熒光定量qPCR檢測木霉融合子Tpf-2厚垣孢子在番茄根際土中的定殖動態,結果見圖3。整個番茄生育周期內(0～150 d),Tpf-2和Tpf-2+Pa處理組中均檢測到木霉融合子Tpf-2的定殖,說明木霉融合子Tpf-2的厚垣孢子可在番茄根際土中長期存活。兩種處理下,木霉融合子Tpf-2的相對定殖數量隨時間的延長呈下降趨勢,并且在同一取樣時間點上,Tpf-2+Pa處理組中木霉融合子Tpf-2的定殖數量高于Tpf-2處理組的定殖數量,說明瓜果腐霉刺激了木霉融合子Tpf-2的定殖。

圖2 目的基因引物與內參基因引物對不同處理 土樣DNA的PCR擴增圖譜Fig.2 Amplification of DNA from different treatments by specific primers Tef1F/Tef1R or internal reference primers TubF/TubR

圖3 木霉融合子Tpf-2在番茄根際土中的qPCR結果Fig.3 qPCR analysis of Trichoderma fusant Tpf-2 colonization in tomato rhizosphere soils

2.2 木霉融合子Tpf-2誘導番茄葉片防御酶活性結果

番茄幼苗期(60 d)葉片中3種防御酶SOD、POD及CAT在不同處理下的活性變化如圖4所示。

與對照CK相比,其他3組處理均能提高番茄葉片中SOD、POD及CAT的活性,但Pa處理組與CK在0.05水平上無顯著性差異,說明瓜果腐霉P.aphanidermatum對3種防御酶的活性影響不大。

Tpf-2及Tpf-2+Pa處理組與CK及Pa處理組間存在極顯著性差異(P<0.01),說明木霉融合子Tpf-2可顯著提高番茄葉片中SOD、POD及CAT的活性。

4組處理中,Tpf-2+Pa處理組的SOD、POD及CAT酶活性影響效應最大,對SOD的誘導效果與Tpf-2處理組間存在顯著性差異(P<0.05),說明病原真菌P.aphanidermatum的存在,可顯著提高木霉融合子Tpf-2對番茄葉片SOD酶的誘導效果;對POD和CAT的誘導效果,Tpf-2與Tpf-2+Pa處理組間存在極顯著性差異(P<0.01),說明在瓜果腐霉P.aphanidermatum存在的情況下,木霉融合子Tpf-2可極顯著誘導番茄葉片POD和CAT活性的提高。

圖4 木霉融合子Tpf-2誘導對番茄葉片防御酶活性的影響Fig.4 Defense enzyme activities of tomato leaf after inoculated with Trichoderma fusant Tpf-2

3 討論

能否在植物上成功定殖是評價生防菌的一個重要指標,傳統方法是對其進行平板稀釋計數,但是此方法費時費工,并且靈敏度不高。而實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)技術因其操作簡單,特異性高等優點被應用到環境中不同木霉菌的檢測[25-26]。

本試驗用到的生防菌株為木霉融合子Tpf-2,經序列分析表明,該融合子的Tef1區與已知木霉其他種類的Tef1區序列差別較大,故以此設計特異引物對目的樣品進行PCR擴增和定量分析,排除了土壤中其他木霉及其他真菌的干擾,保證了分析結果的準確性和可靠性。

相對定量結果表明:木霉融合子Tpf-2厚垣孢子可在番茄根際土中長期定殖,定殖周期不低于150 d,較以前報道的分生孢子的定殖時間不超過100 d[27]大幅延長。Tpf-2和病原菌聯合處理后,Tpf-2定殖數量較不加病原菌的處理組呈增加趨勢,說明病原菌可刺激Tpf-2的定殖量,為病害防治奠定了基礎。前人報道指出,棘孢木霉T.asperellum在黃瓜根際的數量經歷了低-高-低的動態變化,棘孢木霉施入土壤后有一個適應過程,一旦適應后,其定殖數量能夠迅速上升[28]。本試驗中Tpf-2厚垣孢子相對定殖數量隨時間的延長呈降低趨勢,說明Tpf-2厚垣孢子在番茄根際土中并沒有產生明顯的繁殖現象,本結論與文獻報道的有所不同,具體原因有待進一步探討。

木霉是一類能夠誘導植物產生系統抗病性的生物因子,誘導宿主植物產生一系列局部或系統防御反應。防御反應與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等的活性提高關系密切[29-31]。木霉融合子Tpf-2可顯著提高番茄葉片中SOD、POD及CAT的活性,在瓜果腐霉存在的情況下其誘導效果更顯著,說明木霉在番茄遭受病原菌入侵后,能夠對番茄中與抗病相關的3種酶CAT、SOD及POD活性的提高起到一定的誘導作用,從而間接使得植物體獲得抗病作用。

綜上所述,木霉融合子Tpf-2能夠成功定殖在番茄根際,并且能有效誘導植物內在的生防反應物質,提高植物的抗病性。該研究為新的生防菌劑的開發研究奠定了一定的基礎,有助于新型菌劑的開發利用。