不同發酵條件對瓜類細菌性果斑病菌感染 西瓜種子的影響

徐秀蘭, 蘆 鈺, 趙子婧, 吳 萍, 宋順華, 宮國義, 張海軍

(1. 北京市農林科學院蔬菜研究中心, 農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,農業部都市農業(北方)重點實驗室, 北京 100097; 2. 中國農業大學植物保護學院, 北京 100193)

瓜類細菌性果斑病(bacterial fruit blotch,也稱果腐病)是由西瓜嗜酸菌Acidovoraxcitrulli(曾命名Pseudomonaspseudoalcaligenessubsp.citrulli;Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)引起的,可造成西甜瓜減產甚至絕收的毀滅性病害[1-2]。病原菌A.citrulli還可侵染哈密瓜、南瓜、西葫蘆、絲瓜、苦瓜、黃瓜等多種葫蘆科作物[3-4]。自20世紀90年代細菌性果斑病在美國的西瓜種植田大暴發以來,近20年該病在全球多個國家迅速傳播。瓜類細菌性果斑病傳播迅速,主要與A.citrulli通過種子傳帶(seed transmission)和日益頻繁的國際種子貿易相關[5]。目前果斑病在我國北京、山東、新疆、東北、江蘇、海南等多個省市及地區均有危害,不僅給我國的西甜瓜生產造成嚴重的損失,也對西甜瓜制種業帶來了很大沖擊[6]。

A.citrulli可附著在種子表面,并可長期存活于種皮下外胚乳層。制種田田間病害監控、種子檢測、種子處理是病害防控的首要環節。我國西瓜種子采收過程中,往往采用發酵方法脫去種子上連帶的果膠,然而發酵過程對西瓜嗜酸菌的種子感染是否有影響還未見研究報道。本文主要通過控制不同的發酵時間和溫度,研究果斑病菌在發酵過程中對西瓜種子的感染情況,揭示發酵時間和溫度條件對種子帶菌的影響,從而指導病害防控。

1 材料與方法

1.1 菌株培養

菌株:Acidovoraxcitrulli(編號:Xu 3-14)分離自北京順義西瓜發病幼苗,REP-PCR分型為I型。菌株懸浮于15%甘油,保存在-80℃冰箱中。菌株活化培養采用PF培養基(蛋白胨20 g/L,瓊脂15 g/L,甘油10 mL/L,1 mol/L 磷酸氫二鉀14 mL/L,1 mol/L 硫酸鎂 24 mL/L),于28℃培養箱中培養24～48 h。

1.2 西瓜種子發酵與接種

從制種田挑取健康成熟西瓜果實(品種:‘京欣’),果皮清洗消毒后,縱切,掏取種子,放入滅菌的燒杯。每個燒杯放入300 粒種子,100 mL西瓜汁。用搖培24 h的A.citrulliXu 3-14配制菌液,每個燒杯接種Xu 3-14菌液1 mL,其終濃度為106cfu/mL,對照為不接菌的發酵液,設置發酵培養溫度分別為20℃和30℃,4個重復。燒杯放入搖床以60 r/min低速發酵培養,分別在發酵12、24、36、48、60 h時取樣測量發酵液pH,并取1 mL發酵液進行梯度稀釋,涂布于PF培養基上進行分離培養,檢測A.citrulli菌量。分別在24、48、60 h時隨機選取100粒種子,沖洗3次,室溫自然晾干48～72 h,作為種子帶菌檢測的樣本。

1.3 西瓜種子帶菌檢測

對不同發酵溫度、不同發酵時間取出的種子進行種子帶菌分析。分別檢測種子外部和內部帶菌量(分為種皮內部帶菌率及種仁帶菌率)。種子外部帶菌量的檢測方法:將待檢種子(50粒/重復,4個重復)浸入20 mL磷酸鉀緩沖液(80.2 mmol/L K2HPO4, 19.2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)中,使用脈沖振蕩樣品前處理器(HKM shockmixer-1)以93次/s速度振蕩15 s,隨后以28℃,120 r/min條件搖培4 h,取出后再次劇烈振蕩15 s,將浸提液轉移到滅菌的50 mL離心管中,8 000 r/min離心10 min,棄上清,將沉淀重新溶于1 mL 滅菌水中,作為原液。對原液進行梯度稀釋,分別吸取10-3、10-4、10-5稀釋液各100 μL,涂板于PF和半選擇性培養基mEBB培養基上[7-8]。28℃培養3～5 d后,根據菌落形態挑選疑似菌落進行PCR鑒定。種子內部帶菌率通過單粒檢測進行測定,共檢測100粒種子:對待檢種子進行外部消毒(1%次氯酸鈉浸泡5 min后用滅菌蒸餾水沖洗2遍),使用滅菌鑷子將種皮與種仁分離、分別收集到1.5 mL離心管中,加入300 μL磷酸鉀緩沖液，利用旋渦振蕩器充分振蕩15 s后,隨后以28℃,120 r/min條件搖培4 h,取出后再次劇烈振蕩15 s,浸提液直接進行涂板及分子檢測。A.citrulli菌落在PF培養基上很小,呈圓形,淡黃色,菌落表面光滑;在mEBB培養基培養3～4 d后形成直徑約為1～2 mm的菌落,呈圓形,培養4～5 d后,菌落繼續擴大并形成橄欖綠色的中心。菌落純化經PCR確認,并計數推算種子外部帶菌量及種子內部帶菌率。

1.4 西瓜出苗發病檢測

對不同發酵溫度下發酵不同時間的種子(50粒/重復,4個重復)進行出苗檢測。以滅菌的細沙為發芽基質,25℃恒溫條件培養3 d后,繼而在25℃培養8 h,20℃培養16 h,保持培養箱濕度>70%。培養第5天起,每天觀察子葉是否有水浸狀病斑出現,出現癥狀后記錄發病數量,為避免在高濕條件下幼苗之間的病害傳播,及時將發病株取出進行熒光定量PCR檢測確認。

1.5 培養菌落及病株的熒光定量PCR檢測

將種子帶菌檢測分離培養到的典型菌落用無菌水制成108cfu/mL菌液(OD600=0.15),放入-20℃凍融后取1 μL作為反應模板。另取發病苗病健交界部位組織,放入無菌水中研磨,振蕩,取1 μL作為反應模板。以A.citrulliXu 3-14為陽性對照,配制不同濃度梯度菌懸液作為PCR反應模板,以Cq值為x軸,熒光值為y軸繪制標準曲線。陰性對照為無菌水。熒光定量PCR引物和探針序列[9]為BOXAACF: GCG TAT GAG TCC CG AAG AA AT; BOXAACR2: GCA TGC CTT GTA TTC AGC TAT; AAC probe: 6-FAM-CCG AAA TCC GTA TTG GAC GGA TCG AA-BHQ1。擴增體系為25 μL,包括:2×Probe Master Mix 12.5 μL;AAC probe (20 μmol/L) 0.30 μL;BOXAACF (20 μmol/L) 0.35 μL;BOXAACR2 (20 μmol/L) 0.35 μL;滅菌H2O 10.5 μL;樣品模板1 μL。反應擴增條件:95℃ 3 min;95℃ 15 s、60℃ 20 s,40個循環;40℃ 5 min。反應使用Roche羅氏LightCycler?480II儀器進行,使用儀器配套軟件進行數據分析。判定Cq≤35為陽性樣品,Cq>35為陰性樣品。

1.6 試驗設計與數據分析

整個試驗重復2次。數據采用SAS 8.1和Minitab 17軟件進行方差及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同發酵條件下發酵液pH與A.citrulli菌量的變化

在西瓜發酵過程中,不同溫度條件下(20℃, 30℃),發酵液的pH變化趨勢一致。發酵液初始pH為6.5,發酵36 h內pH迅速降低,而后降低趨于緩慢。然而低溫條件下發酵液的pH顯著高于高溫條件下的發酵液。發酵60 h,發酵液pH降低到4.0(圖1)。不同溫度條件下,發酵液中A.citrulli菌量變化則呈現先上升后下降的變化趨勢,菌量均在發酵24 h后達到峰值1010cfu/mL,24 h后菌量呈現下降趨勢(圖2),發酵60 h菌量降低到106cfu/mL。不接菌的發酵液中未檢測出A.citrulli。

2.2 不同發酵條件下西瓜種子帶菌檢測結果

種子外部檢測結果表明,隨著發酵時間的延長,不同溫度條件下的種子外部帶菌量均呈現逐漸下降趨勢(表1)。兩個發酵溫度下,發酵24 h的種子外部帶菌量均達到了108cfu,而發酵48 h和60 h的種子外部帶菌量均大幅下降,降到了105cfu 左右。然而種子內部的病菌感染率只有在30℃發酵溫度下有顯著增高。20℃發酵條件下種皮帶菌率維持在10%左右。此外,30℃發酵條件下,隨著發酵時間的延長種仁帶菌率略有上升,兩個溫度條件下相比,24 h種仁感染率較為接近,平均為1.35%;而48 h時30℃下種仁帶菌率顯著增高到5.5%,20℃條件下在60 h也接近5%。根據梯度涂板稀釋培養菌落數計算,內部種皮的平均帶菌量為1.2×103cfu/粒,種仁的帶菌量為1.5×103cfu/粒。不接菌發酵液對照種子未檢測出A.citrulli。

圖1 不同發酵溫度條件下西瓜發酵液pH的動態變化Fig.1 Kinetic changes in pH values of the watermelon fermentation liquid in 60 hours under different temperatures

圖2 不同發酵溫度條件下西瓜發酵液中Acidovorax citrulli菌量的動態變化Fig.2 The kinetic changes in the bacterial cell density of Acidovorax citrulli in watermelon fermentation liquid in 60 hours under different temperatures

發酵時間/hFermentation time種子外部帶菌量/log10(cfu·mL-1)Bacterial amount on the exterior of seeds20℃30℃內部種皮感染率/%Infestation rate in the interior of seed coat20℃30℃種仁感染率/%Embryo infestation rate20℃30℃24(8.6±0.3)a(7.9±0.2)a(10.8±3.6)a(9.6±1.7)b(1.4±0.9)a(1.3±0.8)a48(7.7±0.1)b(6.9±0.7)b(13.2±4.1)a(15.8±0.8)a(1.4±0.9)a(5.5±0.9)a60(4.6±0.3)c(5.0±0.7)c(10.3±1.6)a(13.8±1.8)a(4.8±2.5)a(4.1±2.2)a

1) 同一列中具有相同字母的數值表示在0.05水平差異不顯著。

Values followed with the same letter listed in the same column indicate no significant difference at 0.05 level.

2.3 不同發酵條件下西瓜種子的幼苗發病率

在不同發酵溫度下發酵不同時間的種子出苗后均有不同程度的發病(圖3),但發病率差異不顯著,均在10%左右。20℃條件下,在同等發酵時間取出的種子發病率相較于30℃略低。在30℃條件下,發酵48 h后,種子發病率達到峰值,為11.7%,而在20℃條件下,種子發病率的最高值發生在發酵60 h后,為10.1%。結果表明西瓜種子發酵過程中,發酵液混入微量A.citrulli菌情況下,會導致西瓜幼苗發病,發病率接近10%。雖然20℃條件下發病率略低,發酵溫度對種子出苗發病率的影響并不顯著。不接菌發酵液對照種子幼苗生長正常,無發病。

2.4 發酵條件與種子內外感菌程度的相關性分析

兩次獨立試驗結果趨勢一致,綜合分析,發現西瓜種子發酵過程中發酵溫度對于A.citrulli感染種子沒有顯著影響,而發酵時間對種子外部帶菌量有顯著影響。發酵溫度、時間對種子內部帶菌和出苗發病率沒有顯著影響,溫度與時間的互作也不顯著(表2)。

圖3 不同發酵時間、溫度條件下收獲的西瓜種子 出苗發病率比較Fig.3 Disease incidence of watermelon seedlings germinated from the seed harvested under different fermentation times and temperatures

影響因素FactorP值 P value種子外部帶菌量Bacterial amount on theexterior of seed種皮內部帶菌率Infestation rate in theinterior of seed coat種仁帶菌率Embryo infestation rate出苗發病率Seedling disease incidence發酵溫度0.233 60.910 00.656 10.393 3發酵時間<0.000 1*0.866 70.459 70.670 9發酵時間×發酵溫度0.133 80.840 40.849 50.908 1

1)*表示顯著(P<0.05)。

*indicates significant difference (P<0.05).

對發酵液pH、發酵液菌量、種子外部帶菌量、種子內部帶菌率和出苗發病率各個指標之間的相關性進行分析,發現發酵液pH、發酵液中的菌量和種子內部帶菌量有顯著相關性(P<0.05)。其中發酵液pH與發酵液菌量的相關系數較高(R2=0.843,圖4),回歸曲線顯示發酵液pH偏低時(5.0～6.0)適宜A.citrulli生長,而pH低于4.0時A.citrulli生長有停滯消亡的趨勢。

3 討論

本項研究首次比較系統地監測了不同溫度條件下,西瓜發酵過程中發酵液中西瓜嗜酸菌的增殖動態,分析了不同發酵條件對種子感染病菌的影響。研究表明,發酵液中西瓜嗜酸菌迅速增殖,并在發酵24 h時可以侵染至種子內部種皮與種仁,發酵溫度對A.citrulli侵染種子的影響不大。

圖4 發酵液pH與發酵液Acidovorax citrulli菌量的 相關回歸曲線Fig.4 Regression analysis between pH value and Acidovorax citrulli cell density in fermentation liquid

已有研究報道認為A.citrulli感染西瓜種子的途徑有兩類:(1)發病果實引起種子帶菌。Rane和Latin[10]發現田間自然發病與人工接種后表現癥狀的果實采收的種子種皮和內部胚可攜帶病菌,而無癥狀表現的果實采收的種子則沒有傳帶A.citrulli。(2)不發病潛伏感染的果實也可產生帶菌的種子。近年來美國Walcott研究組發現:溫室條件下接種花的雌蕊柱頭,雖然果實不表現癥狀,但果瓤和種子均帶菌[11-13]。通過以上研究推斷通過雌花的柱頭感染A.citrulli是田間產生無癥狀果實,造成種子內部帶菌,引起病害流行的原因。然而值得注意的試驗細節是花接種的濃度在107～109cfu/mL,在田間無病害癥狀表現或病害大規模流行的情況下,這樣高濃度的菌量落到雌蕊的幾率很小,在這樣的制種田間采收到的帶菌種子,其實際感染源有待討論。

然而西瓜種子除了在發育過程中會受到感染以外,也有可能在采收和制種過程中受到感染。從西瓜果實取出果瓤和種子后,一般經24 ～ 48 h發酵,清洗,干燥的過程。制種者將包裹著種子的瓜肉堆積,通過發酵,使西瓜果肉與種子徹底脫離,便于種子的收集,也有利于種子內部代謝,便于種子萌發[14]。然而西瓜采收過程中,易混入土壤,雜草或潛伏感染的果實。雖然Hopskin等[15]報道認為發酵使 pH降低,并不適合病原菌生存,本項研究也發現發酵液的pH逐漸降低,然而發酵前期A.citrulli快速繁殖,大大增加了對健康西瓜種子的感染幾率,不僅是種子外部的附著,也伴隨著內部種皮與種仁的侵染。發酵24 h后種皮內部帶菌率10%,種仁帶菌率1%,由此推測病菌通過氣孔,種臍進入種子內部。

現有種子處理方式,無論物理方法或是化學方法,主要針對種子外部攜帶真菌及細菌,對于種子內部帶菌目前沒有十分有效的種子處理方法。發酵作為西瓜種子采收的步驟增加了細菌性果斑病的感染幾率,為了從初侵染源防控這一重要的檢疫性病害的種子傳帶,建議在發酵過程中使用果膠酶以縮短發酵時間,或者加入適當的化學藥劑殺菌。