尖鐮孢脅迫下黃瓜莖部蛋白質差異表達分析

楊 森, 祝海娟, 杜洪銳, 陳瑞雪, 黨悅嘉, 周瑩瑩, 張艷菊*

(1. 東北農業大學農學院, 哈爾濱 150030,2. 哈爾濱市阿城區種子服務中心, 哈爾濱 150030)

植物在逆境脅迫環境下,一些基因被誘導表達,實現植物在蛋白組學水平的適應性調整,構建了植物整個復雜且高效的響應系統。大量研究表明,病程相關蛋白(pathogenesis related protein)是主要的宿主功能蛋白,這些重要的功能蛋白在不同類型互作系統中得到了充分的驗證,明確了各種類型植物防御機制相關功能性蛋白的作用[1-3]。利用蛋白質組學技術構建植物宿主-病原菌互作體系已經成為當前研究的趨勢和熱點之一。

由無性型真菌鐮孢屬尖鐮孢黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumerinum侵染引起的黃瓜枯萎病是黃瓜生產中的重要土傳病害,由于保護地的特殊環境條件和長期連作,土壤中病原菌的積累量越來越多,導致黃瓜枯萎病等土傳病害發生逐年加重。F.oxysporum通常定殖于植物的維管束,對輸導組織產生危害,同時產生相應的毒素,致使莖基部維管束變褐,嚴重地影響了水、礦物質及營養的運輸及黃瓜的生長[4]。植物莖部除了運輸水、礦物鹽、營養和代謝物外,也參與長距離信號運輸,作為對病原菌、共生體和環境壓力入侵的一種反應場所[5]。當病原菌侵染植物時,會有病程相關蛋白及其產物等一系列抗性相關物質產生,其中包括代謝酶、與壓力有關的蛋白質等。

本研究采用雙向電泳技術分析在兩種毒力不同的尖鐮孢脅迫下黃瓜抗感枯萎病品系莖中蛋白質的差異表達,用質譜分析方法鑒定與抗病相關的蛋白質,從蛋白水平初步探索抗枯萎病機制,從而為維管束病害中寄主與病原的互作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜枯萎病高抗品系‘D0327’和感病品系‘649’,由東北農業大學黃瓜課題組提供。尖鐮孢黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumerinum強毒力菌株C9和弱毒力菌株S1,由東北農業大學植物病理研究室提供[6]。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種

將培養在PSA平板上的供試菌種移入PL培養液中,置于25～28℃,轉速110～120 r/min的恒溫搖床中振蕩培養7～10 d。將菌液用4層紗布濾掉菌絲體,濾液在轉速4 000 r/min下離心10 min后移去上清液,加入無菌蒸餾水配制成1.0×107個/mL的孢子懸浮液。于黃瓜幼苗兩片真葉期,采用灌根法將2個毒力不同的尖鐮孢菌株分別接種抗感黃瓜品系[7]。接種后待感病品系‘649’莖部出現變黃癥狀后(7 d)進行取材,將整株莖剪成5 cm莖段用錫紙包好,迅速用液氮處理后置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 黃瓜莖部蛋白質的提取

利用TCA-丙酮法[8],提取黃瓜莖組織蛋白質。利用考馬斯亮藍法[9]測定蛋白質濃度并進行定量。稱取1 g黃瓜莖放入預冷的研缽中,加入液氮研磨至粉末狀;將粉末轉移至2 mL EP管中,加入5倍體積預冷的10%TCA-丙酮溶液,漩渦振蕩至其混合充分,放于-20℃冰箱沉淀過夜; 4℃,13 000 r/min離心30 min,移去上清液;向沉淀中加入5倍體積預冷的丙酮溶液(含0.07%β-巰基乙醇,-20℃預冷),充分混合,置于-20℃冰箱中靜置1 h(期間漩渦振蕩幾次); 4℃,13 000 r/min離心30 min,移去上清液(重復上述步驟6～7次,洗至上清呈無色);沉淀經真空干燥制成蛋白質干粉,-80℃保存備用。

1.2.3 蛋白質雙向電泳

第一向電泳選擇24 cm,pH 4～7的IPG膠條進行等電聚焦,第二向電泳采用12.5%的SDS-PAGE分離膠,雙向電泳結束后進行考馬斯亮藍G-250染色,每個處理進行3次重復。獲得的2-DE凝膠圖像通過Imagemaster 2D Platinum 7.0軟件進行圖像分析。與參考膠比較,特異表達、表達量上調或下調2倍以上被認為是差異表達的蛋白質點。

1.2.4 質譜鑒定和蛋白鑒定

委托哈爾濱賽信生物科技有限公司進行MALDI-TOF-TOF/MS質譜分析。質譜分析結果利用軟件Mascot 2.3.02進行分析,經過NCBI(nr)數據庫和黃瓜基因組數據庫(http:∥www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/index.cgi?organism=cucumber)分析,獲得相關蛋白質點的鑒定結果。

1.2.5 差異蛋白基因表達驗證

在黃瓜基因組數據庫中搜索編碼蛋白的基因,利用在線工具GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design進行設計(https:∥www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)。引物序列發送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成,引物序列見表1。

表1qRT-PCR引物序列

Table1PrimersequencesforqRT-PCR

基因編號Gene no.引物序列(5'-3')Sequence of primerCsEF1αF:CGCTCTTCTTGCTTTCACCCTTR:TACCTTGCCTTGGAGTATTTGGCsa5M611600.1F:GCAACACTTGGCCGTATCATR:AATTTGCTGTTCCGTTGCCTCsa6M484600.2F:CACCATCGGAGCTGAGAGATR:CTCATCCTGTCTGCAATGCCCsa4M063440.1F:TACAGCGTCCAACGTGAATGR:CCCTCCACAAACTTCCTTGCCsa6M450370.1F:TGGTGCAAATGCCATACTCGR:TGCAAGCTTGTTTCCTGCATCsa4M598000.1F:TGGAACAAACGAGGAGGTGAR:CCAGTAAACGCACCACCTTTCsa3M116710.1F:TGGACTCTGATGTGGGAACCR:GTAAACGGGACCTTCTGGGACsa017651F:GGGTGATCTATATGGAAAGCTGGAR:TTCATGTAGGTCGACACCGTCsa6M522690.1F:CCTCTGCAATGGCTCTTTCCR:CTGACTTGCTGGCAGTCTTC

采用TRIzol法提取黃瓜葉片總RNA[10]。根據Toyobo反轉錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT-Kit說明書反轉錄成cDNA。依照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix說明書進行。參照基因為CsEF1α(GenBank Accession Number: XM_004138916)[11]。反應體系SYBR Green PCR Master Mix, 10 μL; 上游引物0.5 μL; 下游引物0.5 μL; cDNA 2 μL; ddH2O 7 μL。反應條件:95℃ 3 min;95℃ 10 s,58℃ 20 s,72℃ 30 s,40次循環;55℃ 10 s,81次循環;4℃,10 min。采用2-ΔΔCT相對定量分析方法計算出基因的相對表達量[12],并用DPS 7.05數據處理系統軟件進行方差及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 尖鐮孢脅迫下不同抗性黃瓜品系莖組織蛋白雙向電泳圖譜分析

2.1.1 C9脅迫下黃瓜抗、感品系蛋白雙向電泳圖譜

利用Imagemaster 2D Platinum 7.0圖像軟件分析,并對分析結果進行篩選,最終確定C9脅迫下感病品系中共有6個符合2倍以上并且有99%統計學顯著性差異的蛋白質點,抗病品系中共有3個差異蛋白點(見圖1)。

圖1 C9脅迫下黃瓜抗、感品系莖部蛋白的雙向電泳圖Fig.1 The 2-DE map of differential protein spots in susceptible and resistant cucumber lines under the stress of C9

2.1.2 S1脅迫下黃瓜抗、感品系蛋白雙向電泳圖譜

S1脅迫下感病品系中共有4個符合2倍以上并且有99%統計學顯著性差異的蛋白質點,抗病品種中共有5個差異蛋白點(見圖2)。從雙向電泳圖譜可以看出,無論感病還是抗病品系,S1脅迫下出現的差異蛋白點大都集中在對照。

圖2 S1脅迫下黃瓜抗、感品系莖部蛋白的雙向電泳圖Fig.2 The 2-DE map of differential protein spots in susceptible and resistant cucumber lines under the stress of S1

點號Spot no.基因編號Gene no.分子量/DaMW等電點pI序列覆蓋率/%Sequence coverage得分Score蛋白名稱Protein name表達模式Expression pattern1Csa5M611600.159 885.25.9036470Enolase上調2Csa6M484600.241 911.05.31721 100Actin上調3Csa4M063440.128 292.37.6144557Oxygen-evolving enhancer protein下調4Csa6M450370.147 942.55.4861752Enolase isoform X1上調5Csa4M598000.127 502.35.6165784Triosephosphate isomerase上調6Csa3M116710.116 450.56.3073657Nucleoside diphosphate kinase上調7Csa01765118 010.95.1544233Csf-2 protein下調8Csa6M522690.128 239.15.1430258Chlorophyll a-b binding protein of LHCII type I上調

2.2 差異蛋白質點的質譜鑒定

通過質譜技術檢測,獲得質譜圖譜,8個PMF出峰情況良好,根據NCBI黃瓜數據庫檢索得到8個陽性結果。通過對兩種尖鐮孢處理后的抗感黃瓜品系進行分析,最終成功鑒定出8個差異蛋白點,其中6個差異蛋白上調表達,2個下調表達,如表2。差異蛋白點的質譜結果如下。

強毒力菌株C9脅迫下,感病品系中鑒定出3個差異蛋白點,分別是1、2和3號,抗病品系中差異蛋白為4、5及6號。弱毒力菌株S1脅迫下,感病品系中差異蛋白為7號,抗病品系中差異蛋白為8號。

1和4號為烯醇化酶及其亞基。在糖酵解中烯醇化酶及其亞基主要參與2-磷酸-D-甘油酸與磷酸烯醇式丙酮酸之間進行相互轉化。

2號蛋白點為肌動蛋白。肌動蛋白是構成真核生物細胞骨架的重要成分,它參與細胞運動,以及多種細胞內過程,對細胞生長、分裂、分化、細胞內囊泡運輸、細胞壁的生物合成、共生現象、胞吞胞吐作用以及膜的循環利用等方面具有較好的控制作用[13]。

3號和8號蛋白點分別為放氧增強蛋白OEE (oxygen-evolving enhancer protein)和捕光復合體I型葉綠素a/b 結合蛋白(LHCII type I chlorophyll a/b-binding protein)。這2個蛋白均與植物光合作用有關,8號蛋白參與光合作用原初反應的蛋白質,主要功能進行捕獲葉綠素,相關研究指出葉綠素的含量與植物的抗病性呈正相關,葉綠素含量升高,植株的抗病性增強。

5號蛋白點為磷酸丙糖異構酶(TPI)。磷酸丙糖異構酶在生物體內的功能主要是參與糖酵解,是糖酵解途徑中的主要蛋白酶。TPI催化磷酸丙糖異構體在二羥丙酮磷酸和D-甘油醛-3-磷酸之間的可逆轉化,是糖酵解中不可或缺的酶。

6號蛋白點為核苷酸二磷酸激酶(NDPK/NDK)。在生物體內核苷酸二磷酸激酶催化磷酸基團在ATP和NDP兩者之間進行可逆的轉移,用以維持ATP和NTP兩者濃度在細胞內的穩定。

7號蛋白點為Csf-2蛋白。該蛋白是一種分泌蛋白,其主要功能與植物防御反應相關,參與應答生物刺激,但具體作用機理尚未清楚。

2.3 差異蛋白基因表達驗證

通過qRT-PCR對差異蛋白基因的表達進行了驗證,結果如圖3所示。8個差異蛋白基因的表達模式均與其蛋白表達相一致,說明差異蛋白是由基因差異表達引起的。

圖3 差異蛋白基因相對表達量 Table 3 Relative expression of differential protein genes

3 討論

蛋白質是生命最直接的體現,在生理及病理條件的改變下,生物體的蛋白會產生結構及功能的變化[14]。植物在被病原物侵染刺激后,其本身會產生一系列的防御反應,尤其是一些病程相關蛋白的表達會有一定的變化[15-16]。本研究采用雙向電泳技術分析在兩種毒力不同的尖鐮孢脅迫下黃瓜抗、感枯萎病品系莖中蛋白質的差異表達,共鑒定出8個差異蛋白。根據其功能不同,將8個蛋白分為能量代謝相關蛋白、光合作用相關蛋白和脅迫反應相關蛋白。

能量代謝相關蛋白為1、4、5、6號,1、4號蛋白為烯醇化酶及其亞基,5號蛋白為磷酸丙糖異構酶(TPI),6號蛋白為核苷酸二磷酸激酶(NDPK/NDK),這4種參與能量生成的蛋白質在本研究中均出現上調表達,且3種在抗病品系出現,說明在同一菌株脅迫下抗感品系表現出一定的差異性,對外界不良環境表現出一定的抗性。這4種與能量相關的蛋白均在高毒力菌株C9的脅迫下差異表達,說明毒力高的菌種可更好地激活植物組織相關蛋白的表達,進而提高抗病性。

光合作用相關蛋白為3、8號,3號蛋白為放氧增強蛋白OEE (oxygen-evolving enhancer protein),8號蛋白為捕光復合體I型葉綠素a/b 結合蛋白(LHCII type I chlorophyll a/b-binding protein)。葉綠素含量與植物抗病性正相關[17],8號是參與光合作用原初反應的蛋白質,與植物葉綠素含量相關,很可能參與黃瓜抗枯萎病的反應。S1菌株脅迫下,8號蛋白在抗病品系中上調表達,而C9菌株脅迫下,3號蛋白在感病品系中下調表達,說明在毒力不同的菌株誘導下蛋白表達存在差異。

脅迫反應相關蛋白為2號,肌動蛋白。該蛋白在高毒力菌株侵染感病品系中上調表達。肌動蛋白普遍存在真核生物中,在細胞外表組織形態的維持、正常生長、細胞運動等中具有重要意義[9,18]。

通過本試驗可以看出在病原菌脅迫下,為適應外界環境的變化,植物體內迅速做出反應,尤其是在毒力強的菌株脅迫下表現得更為明顯。通過分析上述試驗結果,說明參與物質和能量代謝的蛋白與黃瓜抗枯萎病相關。本研究初步探討了黃瓜枯萎病菌誘導黃瓜的抗性應答機理,為進一步篩選抗性相關特異蛋白質作為標記性狀選育新的抗性黃瓜品種奠定理論基礎。