新疆地錦草提取物體外抗氧化及抑菌活性研究

熱子亞·麥麥吐遜， 努斯熱提古麗·安外爾， 祖麗皮亞·玉努斯

(新疆大學生命科學與技術學院， 新疆 烏魯木齊 830046)

地錦草為大戟科植物地錦(EuphorbiahumifusaWilld.)或半地錦(EuphorbiamaculateL.)的干燥全草，廣泛分布于亞洲東部，是常用的中藥材，其性味歸經:辛、平，入肝、大腸經，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃功效，可用于治療痢疾、泄瀉、咯血、尿血，便血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疽等，引起了醫學領域的高度重視。主要化學成分有黃酮類、酚酸類，其鮮汁、水煎劑、醇提液均有抗菌作用。有研究表明，地錦草有很強的抑制和清除自由基的作用，是一個較強的抗氧化植物[1]。

近幾年來,人們對地錦草化合物含量測定、成分分析及其生物學活性的研究取得了很大進展[2]。有文獻報道，地錦草提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌[3],沙門菌和巴氏桿菌[4]等均有明顯的抑制作用。有小鼠灌服地錦草提取物，可明顯增加小鼠的抗氧化能力的研究報告，但針對地錦草提取物體外抗氧化方面的研究較少。本試驗針對新疆地錦草醇、水兩種提取物的體外抗氧化能力及對4種致病菌的抑菌活性進行了研究，為新疆地錦草的進一步開發提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑 地錦草(新疆和田)；試劑：鄰二氮菲、硫酸亞鐵、三氯化鐵、2，2-二苯基-1-苦味酰基自由基(DPPH)等，購自沈陽化學試劑廠，化學試劑均為分析純。培養基：牛肉膏蛋白胨培養基；供試菌株：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌由新疆大學生命科學與技術學院微生物教研室提供。

儀器與設備：潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)；可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)；BCD-216TX型冰箱 (青島海爾股份有限公司)；HH-W型三用恒溫水箱 (江蘇省金壇市醫療儀器廠)；RE-52旋轉式蒸發器 (上海亞榮生化儀器廠) ；DXF200植物粉碎機 (中山市東鳳鎮安密爾電器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 地錦草提取物的制備[5-6]地錦草醇提物，稱取已烘干后粉碎的地錦草10 g，用70%乙醇溶液(1∶15)采用超聲法進行提取1 h，提取3次，真空抽濾，對濾液進行減壓濃縮得濃縮液用干燥箱烘干(45 ℃～50 ℃)后儲存備用。

地錦草水提物:跟上述一樣地錦草料水比為(g/mL)1∶15、溫度為100 ℃、浸提時間為 2 h、重復 3 次，儲存備用。

1.2.2 抗氧化試驗

1.2.2.1 母液的制備 稱取 0.1 g提取物濃縮物放著100 mL容量瓶水溶解并定容，作為母液。稱0.1 g 維生素C 用蒸餾水定容100 mL(1 mg/mL)作為維生素C母液，置于冰箱中備用。

1.2.2.2 還原力的測定 按王曉梅，徐秋萍等[7]方法測定醇提物的還原力，并測定在最大吸收波長處的吸光值。

1.2.2.3 羥基自由基清除率的測定 按努爾阿麗耶·阿卜力米提等[8]的方法將把已準備好的母液分別置于6個試管中，并用蒸餾水候補。依次加入10 mmoL/L FeSO4溶液1 mL，10 mmoL/L的水楊酸-乙醇溶液加入1.00 mL，8.8 mmoL/L的H2O2溶液加1 mL，室溫反應30 min，在最大吸收波長處測定吸光值。羥基自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。式中A0-不加提取物的吸光值，A1-測定液的吸光值，A2-提取物本身的吸光值。

1.2.2.4 DPPH·自由基清除試驗[9]按1.2.2.3方法一樣，分別6個試管，每個試管中分別加入1 mL， 2×10-4mol/L的DPPH·溶液，充分混合均勻，室溫避光反應0.5 h，在最大吸收波長處測定吸光值A，重復3次。并以稀釋10倍的維生素C為陽性對照，操作同上，每個樣重復測定3次。DPPH:自由基清除率(%)=[1-(A-A1)/A0]×100% 。式中:A0-提取物被等體積的蒸餾水代替；A1-DPPH溶液被無水乙醇代替：A-樣品組吸光度。

1.2.3 抑菌試驗

1.2.3.1 菌懸液的制備 先將試驗所用菌株接種于平板上，在37 ℃培養基中培養24 h，然后挑選典型菌落接種于25 mL液體培養基的三角瓶內封口，35 ℃～37 ℃的搖床里震蕩18～24 h，取適量菌液用無菌水稀釋，使菌懸液濃度達到 108個/mL備用[10]。

1.2.3.2 測定地錦草提取物的抑菌效果，并測最低抑菌濃度(MIC)[11]菌懸液按1.2.4.1方法來準備，地錦草醇提液和水提液分別按濃度100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL來準備，取上述菌懸液200 μL加入已倒好的相應培養基平板中搖均成含菌平板。將滅菌的直徑為6 mm的濾紙圓片在提取物中浸泡2 h，貼于平板上，每皿4片，分別設置3個重復，每皿用滅菌的濾紙片做一份空白對照及鏈霉素(100 μg/mL)進行陽性對照，置37 ℃下培養24 h。記錄抑菌圈大小，取平均值，測定醇、水兩種提取物的抑菌活性,其中能夠抑制細菌生長的最低提取物濃度，記為最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.3.3 pH值對地錦草提取物抑菌活性的影響 地錦草提取原液的pH值分別調節為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共8個梯度，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為指示菌，用濾紙片擴散法來測定抑菌圈直徑，試驗重復3次。

1.2.3.4 溫度對地錦草提取物抑菌活性的影響[12]用試管分裝100% 提取物，分別置于80 ℃、100 ℃，120 ℃水浴處理20 min，然后降至室溫。以這4種菌為指示菌采用濾紙片法測定其抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 地錦草提取物抗氧化試驗

2.1.1 還原力的測定 在400～800 nm之間對提取物還原力進行測定，可見最大吸收波長為700 nm。如圖1所示，地錦草醇提取物有一定的還原力，在制定的吸光度處吸光值越大還原力越大，表明還原力與提取物濃度呈現明顯的量效關系。醇提物與維生素C還原力比較，當提取物含量為1.00 mL時，吸光度為0.902 A，維生素C含量為1.00 mL時吸光值為0.792 A，即提取物的還原力大于維生素C的還原力，由此可見提取物具有較強的還原力。

2.1.2 羥基自由基的清除率的測定 在410～710 nm之間進行對羥基自由基清除的測定，發現最大吸收波長為500 nm。如圖2所示，地錦草提取物和維生素C對羥基自由基的清除率隨著濃度的增大而增加，它們含量越大，對羥基自由基的清除率就越大。當提取物濃度大于0.6 mL時，對羥基自由基清除率大于50%，比相同質量濃度下維生素C對OH的消除率高。當質量濃度1.2 mL時兩者的消除率接近，大于70%。

圖1 提取物與維生素C還原力比較

圖2 提取物與維生素C對羥基自由基的清除率吸收曲線

2.1.3 地錦草提取物對DPPH·自由基清除能力的測定 對DPPH·自由基清除率的最大吸收波長為520 nm。如圖3所示，對DPPH·自由基也有較強的清除作用，地錦草提取物抗氧化能力隨著濃度的增加而增強。當提取物濃度大于0.6 mL時，對DPPH的清除率大于50 %。維生素C對DHHP的消除活性低于提取物對DHHP的消除活性，可隨著濃度的繼續增加兩者的消除能力逐漸接近。

圖3 提取物與維生素C液對DPPH的清除能力

2.2 地錦草提取物的抑菌測定

2.2.1 抑菌效果及MIC的測定 由表1、2可見，新疆地錦草兩種提取物都在一定的范圍內對4種供試菌株具有抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用，依次大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>變形桿菌。并可以得出抑菌圈隨提取物濃度的增大而擴大。其中醇，水兩種提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑制濃度一致，MIC為1.56%，醇提物對對枯草芽孢桿菌和變形桿菌的最低抑制濃度為3.125%，而水提物對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為12.5%，對變形桿菌的最低抑菌濃度為25%。

表1 地錦草醇提液濃度對供試菌株抑菌效果的影響

注： 抑菌圈直徑為平均值mm

表2 地錦草水提液濃度對供試菌株抑菌效果的影響

注： 抑菌圈直徑為平均值mm

圖4 pH值對地錦草醇提取物抑菌活性的影響

圖5 pH值對地錦草水提取物抑菌活性的影響

2.2.2 pH值對地錦草提取物抑菌活性的影響 從圖4和圖5可以看出，兩種提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用均受pH值的影響，酸性條件下的抑菌效果較好，在偏酸和堿性條件下的抑菌效果均有下降。這說明pH值的變化對地錦草提取物的抑菌活性的影響較大。

圖6 溫度對地錦草醇提取物抑菌活性的影響

圖7 溫度對地錦草水提取物抑菌活性的影響

2.2.3 溫度對地錦草提取物抑菌活性的影響 由圖6、7可以看出，地錦草提取物經80 ℃、100 ℃、120 ℃的加熱處理20 min后，抑菌活性均有下降的趨勢，但沒那么明顯。說明地錦草提取物具有較強的熱穩定性。

3 結論

通過對地錦草化學成分和生物學活性的研究，人們發現地錦草有明顯的抗菌、抗炎以及很強的抗氧化作用。地錦草是一種具有多種藥理作用的藥物價值很高的植物，近年來引起了國內外學者的極大重視。雖然有關地錦草提取物的體內抗氧化和抑菌作用的文獻很多，但是新疆地錦草在這方面的研究報道比較少。李治建[13]，安惠霞[14]，郭鑫[15]等研究顯示，新疆地錦草對紅色毛癬菌的感染有治療作用。

本試驗對新疆地錦草提取物的抗氧化及抑菌活性的進行研究，結果表明，醇提取物具有一定的還原力，對羥基自由基和DPPH· 自由基均具有一定的清除作用，從各方面可以看出,提取物的抗氧化能力比維生素 C 的抗氧化能力較強。醇、水兩種提取物對4種供試菌都具有明顯的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用比較明顯。地錦草兩種提取物均有較強的熱穩定性，其在酸性條件下(pH值2～9)的抑菌效果較好，其中pH值5的條件下抑菌活性最強；在不同的溫度和pH值條件下，醇提取物的抑菌能力都比水提物的抑菌能力強。

有文獻報道，國內已經開始把抗氧化檢測用于抗氧化，抗衰老等保健食品評價。地錦草具有很強的抗氧化能力，這對保健品的開發提供了重要的指導意義。本試驗雖然明確地錦草對以上4種細菌均有抑制作用，可對抑菌活性成分及機理方面還需要進一步的研究。