多殺菌素微乳注射劑在新西蘭兔體內的藥代動力學研究

鐘恬田， 黎博宇， 趙建國， 楊雨輝， 蘭堅強， 龔幫俊， 韓 謙

(海南大學熱帶農林學院， 海南 海口 570228)

多殺菌素(Spinosad)是20世紀90年代初期開發的一類大環內酯類抗生素，是由土壤中的放線菌刺糖多孢菌(SaccharopoLysporaspinosa)經有氧發酵后產生的胞內次級代謝產物[1]。相比其他殺蟲藥物，多殺菌素有著獨特的作用機制，主要是通過作用于煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)，極大地延長乙酰膽堿(Ach)的作用時間[2-3]。多殺菌素具有高效低毒、高選擇性等優點，介于以上這些優點，該藥于1999年贏得“美國總統綠色化學挑戰獎”[4]。近年來，越來越多的人飼養寵物，研究發現多殺菌素對貓、狗、羊、牛等家畜的蚤類、蜱、虱子等體外寄生蟲有較好的防制作用，多殺菌素的用途越來越廣泛[5]。但該藥難溶于水，口服吸收差，有較大的首過效應，且體內的半衰期短，這些性質嚴重削弱了多殺菌素口服制劑藥效的發揮。多殺菌素微乳液具有熱力學穩定性，可進行熱壓滅菌，其黏度較低，注射時刺激性小，且可以解決其難溶性的問題，藥物從乳劑的油相中緩慢釋放，可以適當延長持效期、減少用藥量且降低給藥次數，大大地提高生物利用度和藥效[6]。

本試驗分別采用了酶聯免疫吸附測定方法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)兩種檢測方法探索家兔皮下注射多殺菌素微乳注射劑后兔血液中藥物的藥代動力學規律，為臨床應用該新劑型治療相關疾病提供部分參考理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本島津公司LC-20AD)；氮氣吹掃儀(北京優晟聯合科技有限公司UGC-45)；超聲波清洗機(深圳市超藝達科技有限公司PS-40)；高速離心機(Eppendorf AG 22331)；磁力攪拌器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司GL-3250A)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司ME204E)；超低溫冰箱(海爾BD-226W)；微型漩渦儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司XW-80A)；酶標儀(美國伯騰儀器有限公司Elx808)；洗板機(北京拓普分析儀器有限公司DEM-3)。

1.2 藥品及試劑 多殺菌素標準品(純度98.5%，由中國農業大學生物學院宋淵教授提供)；油酸乙酯(山東西亞化學股份有限公司)；吐溫80(麥克林)；丙二醇(廣州化學試劑)；甲醇(美國Tedia公司)；乙腈(美國Tedia公司)；乙酸乙酯(廣州省化學試劑工程技術公司)；異戊醇(廣州化學試劑)；肝素鈉(生工生物工程有限公司)；酒精；超純水；0.22 μm微孔濾膜。

1.3 動物 健康新西蘭兔6只，體重1.8-3.7 kg，雌雄各半，購自某新西蘭兔養殖場，飼養于海南大學動物房飼養室。試驗前自飼養2周，且未服用任何可能影響本品代謝吸收的藥物，血液生化指標檢查均正常。采樣期間正常飼養，不限制飲水。

2 試驗方法

2.1 多殺菌素的微乳制備 多殺菌素自乳化的處方含1%多殺菌素原藥，由海南大學熱帶動物醫學與病媒介生物學實驗室研制。該劑型為澄清透明的液體，微帶淡藍色乳光，流動相較好，該處方所選用的輔料均無毒性。該制劑顯著提高了多殺菌素在水中的的溶解度，將其制成自乳化制劑后，一方面不僅可以提高藥物溶解度，而且制劑在體內可自發形成0/W型微乳液，促進藥物吸收，且大大拓寬了該藥的給藥途徑。

2.2 給藥方法和血樣采集 兔子分別編號為1～6號，所有兔子均按照0.25 mg/kg·bw劑量，皮下注射給藥，并在給藥前0.5 h由耳緣靜脈采集空白血樣5 mL，在給藥后的0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0，48.0，96.0，144,192，240,336 h采集血樣1 mL。1、3、5號兔血采集后迅速置于含肝素抗凝的離心管中，3 500 r/min離心10 min，吸取上層血漿轉入另一離心管中，置于-20 ℃冰箱內保存；2、4、6號兔血采集后置于空離心管中，37 ℃下放置2 h，將析出的血清轉移到另一離心管中，置于-20 ℃冰箱內保存。整個試驗期間，嚴密觀察兔子的精神狀態和臨床反應，包括食欲，飲水狀況，大小便和可能出現的胃腸道等方面的不良反應。

2.3 酶聯免疫吸附測定方法測定血清中藥物濃度 向96孔板中加入200 μL由包被緩沖液稀釋的多殺菌素包被原(多殺菌素-OVA)，并于37 ℃ 孵育3 h。使用PBST溶液洗板3次后，每孔加入200 μL脫脂牛奶封閉0.5 h。洗板后每孔加入100 μL標準品或待測樣品，隨后加入100 μL mAb，于37 ℃ 競爭1 h。競爭結束后棄反應液，洗板3次，每孔加入200 μL的PBSTG稀釋的羊抗鼠二抗(IgG-HRP)溶液，于37 ℃孵育0.5 h。洗板后每孔加入200 μL TMB底物顯色液，室溫孵育15～20 min，加入100 μL終止液(2 mol/L H2SO4)，用酶標儀在450 nm處讀取吸光度。

2.4 高效液相色譜法測定血漿中藥物濃度

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-水(49∶49∶2)，使用前經超聲混勻備用；體積流量：1.0 mL/min；檢測波長：246 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL

2.4.2 標準曲線的配制 精密稱取多殺菌素0.01 g 標準品，用甲醇配成0.1 mg/mL的標準溶液，使用甲醇逐級稀釋為400，200，100，50，25，12.5 ng/mL的梯度濃度溶液，經HPLC檢測，用峰面積A對濃度c(ng/mL)作線性回歸，結果表明，多殺菌素在12.5～400 ng/mL內線性關系良好(R=0.9999)。

2.4.3 血漿樣品前處理方法篩選 吸取適量的兔空白血漿，加入一定量的標準液，配制為終濃度為0.025 mg/mL的血漿樣品1 mL，分別經加入樣品量4倍、3倍、3倍的甲醇、乙腈、乙酸乙酯，漩渦10 min后，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液于另一試管中，于40℃下氮氣吹干，殘渣復溶于1 mL乙腈中，過濾膜后經紫外檢測器檢測濃度，經3次重復試驗后，測出峰面積并計算其萃取回收率。萃取回收率=(血漿中藥物的峰面積/對應濃度非血漿中的藥物的峰面積)×100% 最終選擇乙腈蛋白沉淀法作為前處理方法，平均萃取回收率可達86.77%，提取方法可靠。實際測量未知濃度血漿時，應盡可能通過氮氣吹掃的方法，使樣品濃縮，從而減小誤差。

2.4.4 加標回收率試驗 將1 mg/mL標準品儲備液，用空白血漿稀釋配置成0.025、0.2、0.8 mg/mL這3個濃度的待測樣，經2.4項操作后計算回收率和日內、日間精密度，每種溶液3個重復。由標準曲線求得各樣品的濃度，將求得濃度與已知加入濃度相比，回收率=(所算濃度/已知濃度)×100%。其回收率分別為94.5%，表明該方法回收率符合要求；其日內和日間的精密度的相對標準偏差RSD值分別為1.06%，1.57%。結果表明，本試驗條件下所用方法的精密度符合要求,測定方法可靠。

2.5 數據分析處理 采用基于 ExceL 的藥動學數據分析程序-PKsoLver 1.0的非房室模型來處理藥動數據，分別計算出每只新西蘭兔的藥動學參數，然后計算平均值及標準誤，并對兩種分析方法下的數據進行t檢驗分析，同時以血藥濃度平均值對時間作藥-時曲線。

3 結果

血藥濃度曲線和藥物動力學參數 6只家兔單次皮下注射多殺菌素微乳劑后分別經高效液相色譜方法和ELISA方法檢測下不同時間下的血藥濃度曲線見圖1，將藥-時數據輸入藥動學計算軟件PKsolver,采用非房室模型對數據進行處理，確定藥動力學參數[7]。其中Cmax 和Tmax為實測值，其結果見表1。

表1 新西蘭兔皮下注射多殺菌素注射液(0.25 mg/kg·bw)后的藥物動力學參數 (n=6)

圖1 分離菌16S rRNA序列PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

4 討論

4.1 檢測方法的建立 本試驗中采用了兩種方法檢測家兔血液中多殺菌素的含量。經查閱國內外相關文獻后，首先建立了檢測血漿中多殺菌素的提取方法，通過對常用樣品前處理方法：蛋白沉淀法，液液萃取法的比較篩選，最終選擇乙腈作為蛋白沉淀劑對血漿進行處理。其次建立了多殺菌素含量的檢測方法，所用的多殺菌素液相檢測方法的標準曲線R大于0.99,日內與日間變異系數RSD值小于9%,血漿中的內源性物質不干擾多殺菌素的測定,實現了主峰與雜質峰的良好分離，滿足藥動學測定的要求。同時，通過制備多殺菌素單克隆抗體，從而通過間接競爭ELISA反應的方法檢測血清中的多殺菌素含量，該檢測方法的標準曲線R大于0.99，加標曲線回收率可達到穩定在90%以上，同樣可滿足藥動學測定的要求。其中，ELISA分析方法操作方便、靈敏、檢測限低、而液相方法準確、重現性好，但需要通過前處理方法將待測樣品提純后再進行檢測。

4.2 藥動學特征 液相色譜法及酶聯免疫法檢測藥物濃度的半衰期、達峰時間，藥時曲線下面積、平均滯留時間等主要藥代動力參數均無顯著差異，通過兩種方法對血液樣品的檢測，可知多殺菌素在 2～4 h達到最大血藥濃度，而后快速降低，而多殺菌素原藥在口服給藥后的2～8 h到達峰濃度，兩者相比較，微乳注射劑起效更快，可作為動物急性疾病的治療方案。在家兔體內的藥代參數值與在狗體內的相比，動物體內代謝可見相似的趨勢特征，但仍存在一定的種屬差異，主要表現在藥物半衰期在兔體內時間略短于在狗體內[8]，這可能跟動物胃部pH值存在一定的聯系，該制劑在新西蘭兔體內分布廣泛，持續時間較長。本試驗中家兔按0.25 mg/kg·bw， 一次皮下注射后，30 min后血漿中多殺菌素即可達到187.13 ng/mL,60、90 min分別達到228.47、318.95 ng/mL，至48，96 h之后血漿中藥物濃度維持在 94.98、71.28 ng/mL。在該制劑的藥效預試驗中可證明該給藥劑量可對多種體內外寄生蟲,比如虱子、螨蟲、腸道線蟲等起到有效的防制作用。

4.3 制劑特點 微乳作為一種新型的給藥系統，大大增加了多殺菌素的溶解性，降低了在給藥過程中對動物的刺激性和毒性。同時，微乳具有不良反應小，容易被機體代謝，可供注射使用的優點。多殺菌素微乳注射劑質地較稀，黏度不高，在注射劑過程中易于抽取和推注，具有較好的實用優勢和應用前景。