上海市鴨源沙門菌的分離鑒定、血清分型及耐藥性分析

瞿孝云， 許學斌， 邱榮超， 張麗娜， 符 穎， 張建民， 廖 明

(1.華南農業大學獸醫學院 人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室， 農業部人畜共患病重點實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室， 廣東 廣州 510642 ； 2.上海疾病預防控制中心病原微生物鑒定所 上海 長寧 200336 ； 3.河南牧業經濟學院動物科技學院，河南 鄭州 450011)

沙門菌(Salmonella)是一種重要的人獸共患病病原菌，也是一種重要的食源性致病菌。其血清型高達2 500多種，多數對人、家畜和家禽等均有致病性，不僅給養殖業造成很大的危害，而且具有很重要的公共衛生意義。而動物源食品作為沙門菌的重要載體，是人類感染沙門菌的一個重要源頭[1]。CDC數據顯示,美國每年約有120萬人患病，死亡數近450人[2]；中國每年大概有820萬人感染，引起792人死亡[3]。國內外對禽沙門菌的研究主要集中在雞，鴨源沙門菌研究較少，與歐洲以及美洲多數國家不同的是,我國是傳統的鴨養殖與消費大國,鴨肉以及鴨蛋的產量居于世界第一位。因此,我國居民因食用受污染的鴨肉以及鴨蛋而感染沙門菌病的幾率較其他國家會更高[4]。上海作為畜禽產品消費大市，畜禽產品的供應和安全性直接關系到社會穩定和人民群眾健康。但目前，缺乏對上海地區鴨源沙門菌流行情況和耐藥數據的監測。

因此，本研究通過對上海各大農貿市場和超市鴨源沙門菌的分離、血清學分型和藥敏試驗，為鴨源沙門菌的防控提供數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2014年從上海市各區3家大型超市和7個零售市場隨機采集不同的鴨肉制品(如鴨掌、鴨心、鴨胸肉、鴨腿、鴨翅，整鴨、鴨糞便等)樣品共計186份。放入無菌采樣袋內，所有樣品采集后均置于低溫保存箱中，于 8 h內送至實驗室。

1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硒酸鹽煌綠(SBG)增菌液、沙門菌顯色培養基、無菌采樣袋,均購自青島海博生物技術有限責任公司；木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉(XLT4)培養基、LB營養瓊脂、LB肉湯、MH瓊脂,購自廣東環凱生物技術有限公司；API20E試條(bioM erieux, Inc.),購自北京威泰科生物技術有限公司；沙門菌屬診斷血清,購自寧波天潤公司；藥敏紙片,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。TaqDNA聚合酶和1 000 bp Marker,購自TaKaRa公司。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922由華南農業大學獸醫學院動物傳染病教研室保存。

1.3 方法

1.3.1 沙門菌分離培養 根據國家標準(GB 4 789.4-2010)規定并結合本實驗室經驗進行沙門菌的分離鑒定。按照每 25 g樣品加 250 mL無菌BPW的原則，于 37 ℃，100 r/min的條件下進行4～6 h預增菌。移取上述1 mL增菌液分別轉移于10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液內，于 42 ℃±1 ℃和36 ℃±1 ℃培養 18 h～24 h。分別用接種環取選擇性增菌液三區劃線接種于XLT4瓊脂平板和沙門菌顯色瓊脂平板上，于36 ℃±1 ℃分別培養24 h～36 h，觀察平板上菌落的形態。沙門菌在XLT4 瓊脂平板上的典型形態為黑色、圓形、邊緣透明菌落，或者無色、透明菌落；在沙門菌顯色瓊脂平板上顯紫色。

1.3.2 沙門菌的鑒定 挑取疑似菌落，同時進行生化鑒定和 PCR 鑒定。選擇沙門菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定：從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備呈濁度適當的菌懸液，取適量加入不同生化管中，至于37 ℃培養箱中過夜培養，次日觀察細菌對三糖鐵、吲哚、甲基紅和V-P等的利用結果并記錄。根據參考文獻[5]，選擇沙門菌屬侵襲性抗原保守基因invA序列設計1對引物，P1：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′;P2：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′。由上海英濰捷基生物技術有限公司合成，擴增目的片段大小為284 bp。PCR擴增條件94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環，72 ℃延伸10 min。

1.3.3 沙門菌血清型鑒定 使用寧波天潤公司的沙門菌屬診斷血清對分離株進行血清分型，按照說明書操作，在干凈載玻片上滴1滴血清，取少量被檢菌苔與血清混勻，用無菌牙簽輕輕混勻并于1 min 內肉眼判斷結果，以生理鹽水作陰性對照。出現凝集者為陽性，呈均勻渾濁者為陰性。根據測定得到的抗原式，參照White-Kauffmann-Le Minor(WKLM)抗原表，檢索沙門菌的血清型[6]。

1.3.4 藥敏試驗 選用16種常見的抗生素藥敏紙片,包括四環素(30 μg/片)、氨芐西林(10 μg/片)、奧格門汀(20 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、亞胺培南(10 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、頭孢吡肟(30 μg/片)、頭孢噻肟(30 μg/片)、頭孢噻甲羧肟(30 μg/片)、磺胺異唑(300 μg/片)、復方新諾明(磺胺甲唑23.75 μg/片+甲氧芐啶1.25 μg/片)、萘啶酸(30 μg/片)、環丙沙星(5 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、甲氧芐胺嘧啶(5 μg/片)。采用WHO推薦的藥敏紙片瓊脂擴散法(Kirby-Baue法)測定分離菌株對抗菌藥物的敏感性，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，最后測量抑菌環直徑，結果參照CLSI制定的標準[7]判定敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)。

2 結果與分析

2.1 沙門菌的分離鑒定 從采集的186份鴨源樣品中，分離到疑似沙門菌菌株44株。這些菌株在XLT4平板上長出黑色、圓形、半透明光滑菌落；在沙門菌顯色板上呈紫色，符合沙門菌典型生長特征。將所有疑似菌株進行生化試驗鑒定，都可以分解葡萄糖產酸產氣，發酵麥芽糖、甘露糖，不發酵乳糖、蔗糖，不產生吲哚, H2S試驗陽性、V-P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗陰性。從電泳圖譜上可以看出，擴增產物大小在284 bp左右，條帶單一(見圖1)。綜上，本研究共分離鑒定出44株鴨源沙門菌，分離率為23.65%。

圖1 沙門菌invA基因PCR檢測

1～8、10～17、19～21：沙門菌分離珠； 22：陰性對照；9、18：DNA Marker DL-1 000

2.2 血清型分布 血清學分型結果(圖2)顯示，44株鴨源沙門菌共鑒定出13種血清型，優勢血清型為鼠傷寒沙門菌19株 (43.18%)和腸炎沙門菌6株(13.64%)，其次為科瓦利斯沙門菌4株(9.09%)、德比沙門菌4株(9.09%)和阿爾巴尼沙門菌3株(6.82%)，另外還檢出阿爾頓沙門菌、哈瓦那沙門菌、利物浦沙門菌、姆班達卡沙門菌、山夫登堡沙門菌、約翰內斯堡、阿貢納沙門菌、印第安納沙門菌各1株(2.27%)。

圖2 44珠鴨源沙門菌血清型分布結果

2.3 抗生素耐藥性 對44株鴨源沙門菌進行了16種常見抗生素的耐藥性檢測。耐藥性結果(表1)顯示,對萘啶酸(63.64%)、磺胺異唑(47.73%)、鏈霉素(47.73%)、四環素(40.91%)的耐藥率最高；其次是氨芐西林(34.09%)、氯霉素(27.27%)、復方新諾明(25.00%)、甲氧芐氨嘧啶(22.73%)；對奧格門汀(4.55%)、頭孢吡肟(4.55%)、頭孢噻肟(4.55%)、頭孢噻甲羧肟(4.55%)、環丙沙星(2.27%)、慶大霉素(2.27%)耐藥率較低；但對氧氟沙星(0.00%)和亞胺培南(0.00%)兩種藥物敏感。

在44株鴨源沙門菌分離株中，發現5株(11.36%)不耐藥，其對16種抗生素均表現敏感；20株對1～2種抗生素耐藥，血清型以鼠傷寒為主；其他19株則表現出多重耐藥現象(至少耐3種及3種以上抗生素)，多重耐藥率為43.18%，耐藥模式多樣且主要的耐藥表型為TET+AMP+SXT+C+W+S3(表2)。同時耐6種及6種以上抗生素的沙門菌有11株，耐11種抗生素的沙門菌有2株。

表1 44株鴨源沙門菌藥敏試驗結果

表2 44株鴨源沙門菌多重耐藥情況

注：TET:四環素；C: 氯霉素；GEN:慶大霉素；S:鏈霉素；S3:磺胺異唑；W:甲氧芐氨嘧啶；SXT:復方新諾明；FEP：頭孢吡肟；CTX：頭孢噻肟；CAZ：頭孢噻甲羧肟；IMP:亞胺培南；AMP:氨芐西林；AMC:奧格門汀；NA:萘啶酸；CIP:環丙沙星；FOX:氧氟沙星

3 討論

沙門菌廣泛存在于動物體本身、動物養殖環境和動物性食品中，是引起食物中毒最常見的病原菌之一。據相關文獻報道，在我國細菌性食物中毒中，70%至80%是由沙門菌引起的[8]，而全球每年約有9 300萬人感染沙門菌，死亡數高達15.5萬[9]。

本研究以傳統方法與PCR 鑒定相結合，最終鑒定出44株鴨源沙門菌，陽性率為23.65%，明顯高于2005年李紅星等[10]對河南地區鴨源沙門菌的調查(陽性率11.28%)，說明該地區沙門菌污染廣泛存在于市場和超市中。提示應做好衛生監督防控，降低污染率。

本研究血清學分型結果顯示，共鑒定出13種血清型。其優勢血清型為鼠傷寒沙門菌(43.18%)和腸炎沙門菌(13.64%)。據報道[11]從發病鴨體內分離到腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌較多。這兩種血清型感染的宿主范圍廣，是引起各種動物的沙門菌感染和人類食物中毒的主要血清型之一。另外還檢出11種其他血清型沙門菌，如阿爾頓沙門菌、哈瓦那沙門菌、利物浦沙門菌、姆班達卡沙門菌、山夫登堡沙門菌、約翰內斯堡、阿貢納沙門菌、印第安納沙門菌，可以看出上海地區鴨源沙門菌血清型分布較廣，因此需加強對流行菌株的監測。

本研究對44 株鴨源沙門菌進行了16 種抗生素的耐藥性試驗，結果顯示，分離株對萘啶酸、磺胺異噁唑、鏈霉素、四環素的耐藥性較強(耐藥率超過40%)，與有關報道基本一致[12]推測這可能與生產上長期不合理使用抗生素有密切關系。頭孢類藥物和氟喹諾酮類藥物作為臨床一線用藥，具有較好的抗菌療效，可數據表明，本次分離株中已出現對此類藥物的耐藥菌株，對奧格門汀、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢噻甲羧肟、環丙沙星的耐藥率范圍在2.27%～4.55%，但分離株對氧氟沙星和亞胺培南都敏感，符合相關報道[13]。說明耐藥菌株的出現與長期使用該類藥物有一定的相關性。本次檢測的菌株多重耐藥率達43.18%，且多重耐藥譜廣，耐藥譜型繁多。耐藥最多的菌株可同時耐受11種藥物，多重耐藥菌株的主要耐藥表型為四環素(TET)-氨芐西林(AMP)-復方新諾明(SXT)-氯霉素(C)-甲氧芐氨嘧啶(W)-磺胺異口惡唑(S3)，均為臨床基礎用藥。同時耐6種及6種以上抗生素的沙門菌有11株。結果表明，上海地區鴨源沙門菌耐藥情況比較嚴重，提示在養殖、臨床治療和預防過程中應該科學合理的使用抗生素。如果長期不合理的使用或濫用抗生素，將導致沙門菌耐藥性的形成和耐藥基因的轉移，最終會對人類健康構成嚴重的威脅。

本研究顯示，上海市各大農貿市場和超市中鴨源沙門菌污染率較高，其血清型分布廣且耐藥模式多樣，呈現較高耐藥性。提示為降低沙門菌引起的食品安全風險，有關部門應加強衛生監督以及重視對沙門菌污染和抗生素規范使用的監測。