豬瘟病毒感染西藏小型豬致免疫器官損傷的組織病理學(xué)研究

廖潔丹， 范雙旗， 朱夢嬌， 徐海鑾， 趙明秋， 陳金頂

( 1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528225 ; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種高度接觸性、急性、熱性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。CSF是一種免疫抑制性疾病，可引起機體白細胞數(shù)量減少、淋巴細胞亞群發(fā)生改變，造成免疫器官病理損傷和機體免疫功能抑制。有研究表明，CSFV能在單核巨噬細胞中復(fù)制，引起機體免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、運動系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等功能障礙[1-2]，引起線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和死亡受體等多種細胞凋亡途徑[3]，感染晚期病豬的扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腎臟等組織中均能檢測到病毒。目前，我國關(guān)于CSFV感染引起的免疫系統(tǒng)組織病理學(xué)變化報道較少[4]，我們的前期研究已證明西藏小型豬對CSFV敏感[5]，本研究將進一步開展CSFV感染西藏小型豬后對免疫器官的組織病理學(xué)研究。本研究運用CSFV石門株人工感染4月齡西藏小型豬，感染成功后采集扁桃體、頜下淋巴結(jié)、脾臟、胸腺等組織器官進行病理學(xué)觀察，從組織病理學(xué)角度系統(tǒng)分析豬瘟感染西藏小型豬后對其免疫器官的病理損傷，為揭示CSFV感染引起機體的免疫抑制及研究其致病機理提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 病毒 CSFV 石門株、pMD18-T-NS5B質(zhì)粒均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室保存。

1.2 試驗動物 6頭4月齡、體重約20～25 kg、未免疫CSF疫苗的健康西藏小型豬，經(jīng)檢測CSFV、豬偽狂犬病病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒II型、豬細小病毒和豬口蹄疫O型病毒抗體和抗原均為陰性，購自廣州南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.3 主要試劑 甲醛、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、蘇木精染液、伊紅為分析純，購自北京化學(xué)試劑公司；中性樹膠、高級切片石蠟，購自上海華永石蠟有限公司；CSFV抗體檢測試劑盒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒抗體檢測試劑盒、豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測試劑盒(美國IDEXX公司)；豬圓環(huán)病毒II型抗體檢測試劑盒、豬口蹄疫O型病毒抗體檢測試劑盒(韓國金諾JBT公司)；豬細小病毒抗體檢測試劑盒(武漢科前動物生物制品有限責任公司)；One Step SYBR Prime Script RT-PCR KitⅡ試劑盒(TaKaRa公司)。Viral RNA Kit抽提試劑盒、質(zhì)粒稀釋液(TaKaRa公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(OMEGA公司)。

1.4 主要儀器 Shandon Pathcentre全自動密封式脫水機(英國)；石蠟包埋機(Microm EC300型)；切片機(Microm HM340E型)；烘箱(博造機械設(shè)備有限公司)；全自動染色封片一體機(Leica ST5020型)；奧林巴斯生物顯微鏡(BX43型)。酶標儀〔賽默飛世爾(上海)儀器有限公司〕；全自動洗板機、熒光定量PCR(美國Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1 動物分組和感染試驗 8頭健康西藏小型豬隨機分成2組，CSFV感染豬4頭(♀2，♂2)，對照組2頭(♀1，♂1)，感染豬頸部肌肉注射CSFV石門株血毒(1×105TCID50/頭)，對照組頸部肌肉注射等體積生理鹽水。感染豬和對照組豬只隔離飼養(yǎng)。

2.2 CSFV感染豬體溫和臨床癥狀觀察 每天記錄感染豬和對照組豬只體溫、精神狀態(tài)、被毛、皮膚、飲欲和食欲、糞便等情況。

2.3 CSFV感染豬血液病毒檢測 以感染當天定為0 DPI(Days post inoculation, DPI)計算，于9 DPI采集CSFV感染豬和對照豬前腔靜脈血測定血液中CSFV核酸載量。根據(jù)參考文獻[8]設(shè)計熒光定量PCR擴增的CSFV-NS5B引物，用Viral RNA Kit抽提試劑盒抽提感染豬血液CSFV RNA，計算CSFV 拷貝數(shù)，具體方法見文獻[5]。

2.4 CSFV感染豬組織/器官病理變化觀察 CSFV感染后9 DPI，2頭豬體溫低于正常體溫時對所有試驗豬只逐一剖殺。記錄各臟器的主要病理變化，并釆集扁桃體、頜下淋巴結(jié)、脾臟、胸腺等免疫器官用4 %福爾馬林固定后，按參考文獻[6]方法進行組織樣本石蠟的固定、脫水、浸蠟、包埋、切片和烘片；組織樣本H.E.染色、封片后進行光學(xué)顯微鏡觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1 CSFV接種豬臨床癥狀 CSFV感染豬的2 DPI，感染豬體溫全部升高至40.2 ℃以上，呈現(xiàn)高熱稽留至8 DPI，對照組豬只體溫正常。CSFV感染豬1 DPI未出現(xiàn)明顯CSF臨床癥狀，精神狀態(tài)、飲欲和食欲、被毛和皮膚正常。2 DPI個別豬只出現(xiàn)精神沉郁、喜歡臥睡，食欲減退、偶見便秘癥狀。隨著感染時間增長，CSF臨床癥狀明顯，5 DPI時感染豬行走搖擺，以臥地嗜睡為主，食欲停止，飲欲減少，個體消瘦明顯，眼結(jié)膜充血，有少量膿性分泌物。6 DPI時飲欲停止，眼結(jié)膜有大量分泌物，個別豬只出現(xiàn)拉稀。9 DPI體溫低于正常體溫，感染豬極度消瘦、被毛松亂、虛弱臥地不起。對照組豬只一切正常。

3.2 CSFV感染豬血液病毒量檢測 運用熒光定量 RT-PCR 方法測得4頭感染豬血液CSFV RNA載量最高達1×108.9Copies/mL，最低為1×105.2Copies/mL，其余2頭感染豬血液CSFV RNA載量分別為1×108.5Copies/mL和1×107.7Copies/mL。對照組豬血液CSFV 抗原和抗體結(jié)果為陰性。

3.3 CSFV感染豬組織/器官病理變化觀察 CSFV感染豬喉頭輕度出血；扁桃體出血、水腫；全身多處淋巴結(jié)出血和水腫，特別是頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)腫大和出血嚴重，切面類似大理石樣病變；部分感染豬心臟有出血點；肺臟表面有暗紅色出血斑；脾臟邊緣有出血性梗死灶；腎臟表面出現(xiàn)針尖大小的出血點；腸道內(nèi)壁點狀出血；膀胱內(nèi)壁點狀出血，結(jié)果見中插彩版圖1。對照組豬只組織器官未見明顯病理變化。

3.4 CSFV感染豬組織病理學(xué) CSFV感染豬的胸腺、扁桃體、頜下淋巴結(jié)、脾臟等免疫器官的組織病理學(xué)結(jié)果見中插彩版圖2。感染豬胸腺被膜完整，間質(zhì)炎性細胞浸潤，可見淋巴細胞壞死，發(fā)生核固縮、巨噬細胞増多，可見少量嗜中性粒細胞；扁桃體黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，隱窩周圍固有層內(nèi)有大量彌散淋巴組織及淋巴小結(jié)節(jié)，可見淋巴濾泡增生，淋巴小結(jié)的部分淋巴細胞發(fā)生核固縮、核崩解破裂，并可見多量紅細胞；頜下淋巴結(jié)被膜完整，淋巴小結(jié)中的淋巴細胞發(fā)生變性和壞死，可見多量核固縮和核碎片、以及含鐵血黃素及巨噬細胞，部分淋巴小結(jié)的生發(fā)中心可見局部增生性變化；脾臟部分脾小體結(jié)構(gòu)消失，僅見中央動脈，脾白髓體積縮小，白髓和紅髓堆積大量紅細胞及含鐵血黃素，可見淋巴細胞變性壞死、正常的淋巴細胞數(shù)量減少。對照組豬只的胸腺、扁桃體、頜下淋巴結(jié)和脾臟組織結(jié)構(gòu)正常。

4 討論

CSFV是一種對免疫細胞具有親嗜性的病毒，能在體內(nèi)外的骨髓細胞種類中復(fù)制，其中單核巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞是病毒入侵宿主的早期靶細胞。研究表明，CSFV感染早期，血液中某些細胞因子如IFN-α和TNF-α等細胞因子水平上調(diào)，它們間的相互作用是免疫細胞發(fā)生死亡的重要因素之一[7]。CSFV 感染后以淋巴細胞凋亡或壞死為主要方式抑制宿主的非特異性免疫應(yīng)答并延緩特異性免疫應(yīng)答[8]，以達到有效逃避宿主的免疫系統(tǒng)防御的目的。有研究報道，CSFV感染后以扁桃體、脾臟、頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、回盲瓣中的病毒含量較髙[9-12]，CSFV弱毒株發(fā)病期嚴重損傷淋巴組織，中等和弱毒株對淋巴器官的損傷都具有持續(xù)和不可恢復(fù)性[13]。

本研究通過CSFV石門毒株人工感染西藏小型豬，通過CSFV感染豬的臨床表現(xiàn)、體溫變化、剖檢病理變化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSFV感染導(dǎo)致的組織器官病變與觀察的臨床癥候規(guī)律相一致，表明成功復(fù)制CSFV急性感染西藏小型豬的動物模型。4頭感染CSFV的西藏小型豬在2 DPI時體溫升高至40.2 ℃～41.4 ℃，表現(xiàn)出不同程度的精神沉郁、食欲減退、便秘等臨床癥狀。CSFV感染豬的組織器官病理變化顯示：扁桃體出血，全身淋巴結(jié)出血、腫脹，脾臟邊緣有出血性梗死灶，腎臟表面出現(xiàn)針尖大小的出血點，膀胱內(nèi)壁點狀出血等具典型CSF病理變化。本研究與同劑量石門株急性感染巴馬小型豬[10]的報道結(jié)果比較，其CSF特征性病理變化明顯，說明西藏小型豬比巴馬小型豬對CSFV更敏感。

CSFV感染后首先侵入扁桃體腺窩上皮細胞繁殖，借助血液循環(huán)將病毒擴散到骨髓、胸腺、淋巴組織、脾臟等免疫器官。當CSFV進入胸腺后導(dǎo)致胸腺的萎縮，可以觀察到其皮質(zhì)和髓質(zhì)間有大量凋亡細胞，細胞凋亡的數(shù)量與感染CSFV的時間呈正相關(guān)[14]。本研究的組織病理研究結(jié)果顯示：扁桃體隱窩周圍固有層內(nèi)有大量彌散淋巴組織及淋巴小結(jié)節(jié)，可見淋巴濾泡增生，淋巴小結(jié)的部分淋巴細胞發(fā)生核固縮、核崩解破裂，并可見多量紅細胞；頜下淋巴結(jié)的淋巴細胞發(fā)生變性和壞死，可見多量核固縮和核碎片、以及含鐵血黃素及巨噬細胞，部分淋巴小結(jié)的生發(fā)中心可見局部增生性變化；脾臟的部分脾小體結(jié)構(gòu)消失，脾白髓體積縮小，白髓和紅髓堆積大量紅細胞及含鐵血黃素，可見淋巴細胞變性壞死、正常的淋巴細胞數(shù)量減少。本研究的組織病理學(xué)結(jié)果與CSF慢性感染長白豬[2]和CSFV石門株急性感染巴馬小型豬的報道結(jié)果類似[10]。由此可見，CSFV 急性感染西藏小型豬后扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟等外周免疫器官是病毒感染的首選靶器官，脾臟和淋巴結(jié)的淋巴濾泡發(fā)生出血和壞死，造成了T、B淋巴細胞減少；脾小體結(jié)構(gòu)消失，直接導(dǎo)致淋巴細胞功能衰退，機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體的能力下降，防御功能降低[2]，豬只的免疫功能損傷和機體免疫應(yīng)答受到抑制。有研究報道，CSF瀕臨死亡期豬的胸腺細胞和正常豬胸腺細胞的表型有顯著差異[15]，有學(xué)者對胸腺中巨噬細胞的超微結(jié)構(gòu)進一步研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞體積增大且細胞質(zhì)含有大量細胞和細胞核碎片，同時在核濃縮的細胞周圍存在大量的巨噬細胞[12]。我們的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，胸腺間質(zhì)炎性細胞浸潤，淋巴細胞壞死并發(fā)生核固縮，巨噬細胞増多和有少量嗜中性粒細胞等組織病理學(xué)變化，以上的現(xiàn)象揭示細胞凋亡在強毒感染后導(dǎo)致胸腺萎縮中可能發(fā)揮著重要的作用。本研究成功建立CSFV感染西藏小型豬的動物模型，從組織病理學(xué)角度系統(tǒng)分析CSFV感染西藏小型豬后對其中樞免疫器官和外周免疫器官的病理損傷，為揭示CSFV感染引起機體的免疫抑制及研究其致病機理提供重要參考。