番鴨Viperin基因的克隆表達及其抗MDRV的作用研究

陳潔瀅， 孫亞楠， 邵文涵， 池曉娟， 陳吉龍， 王 松

(福建農林大學動物科學學院， 福建 福州 350002)

番鴨呼腸孤病毒病是由番鴨呼腸孤病毒(MDRV)引起的一種以腳軟、肝脾有大量白色壞死點、高發病率和高病死率為特征的新的急性傳染病，對番鴨養殖業造成極為重大的經濟損失。機體天然免疫系統是抗病毒感染的第一道防線，病毒感染宿主后，天然免疫系統會被激活，經細胞中一系列的信號傳導，誘導宿主分泌多種抑制病毒的細胞因子。干擾素(Interferon，IFN)是最重要的細胞因子之一，在抵抗病毒的過程中發揮著重要作用，干擾素可以與細胞表面的特異性受體結合，進而誘導上千種干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表達[1]。MDRV感染后能迅速激活宿主天然免疫信號通路，誘導IFNs及某些重要ISGs的大量表達[2]。從ISGs被發現以來，國內外學者不斷探索ISGs在病毒侵襲宿主過程中發揮的作用及作用機理，目前對包括Viperin在內的少數ISGs的抗病毒機制有較深入的了解[3]。

Viperin，也被稱為cig5和RSAD2，是一種重要的ISGs，是與內質網相關的抗病毒蛋白，可被干擾素、細菌脂多糖(LPS)、poly ( I ∶ C) 和多種病毒等誘導表達，具有廣譜抗病毒活性[4]，對淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)[5]、丙型肝炎病毒(HCV)[6]、登革熱病毒(DENV)[7]、基孔肯雅病病毒(CHIKV)[8]、仙臺病病毒(SeV)[9]、A型流感病毒(IAV)[10]、日本腦炎病毒( JEV)[11]、人類免疫缺陷病毒(HIV)[12]和西尼羅河病病毒(WNV)[13]等多種病毒具有抑制作用。但目前還未有文獻報道番鴨Viperin蛋白在番鴨體內的表達情況，以及其對MDRV復制影響的相關研究。本研究首先檢測了番鴨Viperin基因在感染MDRV細胞和雛番鴨組織中的表達情況；然后，克隆番鴨Viperin 基因到真核表達質粒，并對Viperin在MDRV復制中的作用進行了研究。本研究首次證實番鴨Viperin蛋白具有抗MDRV的作用，為抗MDRV藥物的篩選和研制提供了新的選擇，也為番鴨Viperin 蛋白抗病毒活性的初步評價提供了依據。

1 材料

1.1 細胞、病毒、實驗動物和菌株 293T細胞，由本實驗室保存；番鴨鴨胚成纖維細胞(MDEF)，分離自11～13日齡的番鴨胚；MDRV病毒YB株，由福建農林大學動物科學學院吳寶成老師惠贈；番鴨購自廣東溫氏食品集團有限公司莆田分公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞，購自天根生化科技( 北京) 有限公司。

1.2 培養基及主要試劑 DMEM、胎牛血清，Gibco 公司生產； 核酸限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 連接酶、Pyrobest 高保真DNA 聚合酶、Taq酶、Oligo d( T) 18 Primer、Recombinant Dnase I、Cloned Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mixture、核酸Marker，均由TaKaRa 公司生產；真核轉染試劑VigoFect，威格拉斯生物技術有限公司生產；NC膜，Millipore 公司生產；蛋白預染Marker，Thermo Scientific 公司生產；ECL 化學發光液，普利萊基因技術有限公司生產；Flag 標簽抗體、過硫酸銨和十二烷基磺酸鈉，均由Sigma 公司生產； 羊抗鼠二抗，Santa Cruz 公司生產；丙烯酰胺，國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.3 主要儀器 細胞恒溫培養箱(型號為MCO175)，SANYO 公司生產；生物安全柜(型號為Biobase BSC-1100IIA2-X)，BioBase 公司生產；倒置顯微鏡(型號為Ti-E)，Nikon公司生產；普通離心機(型號為Micro-17 )、冷凍離心機(型號為Theromo Fisher labofuge 400R)，均由Thermo Scientific公司生產；低溫離心機(型號為Eppendorf 5424R)由Eppendorf公司生產；普通PCR儀(型號為T100)、凝膠成像系統(型號為GeIDoc XR + )，均由Bio-Rad公司生產；熒光定量PCR儀(LightCycler?96)，由羅氏公司生產；化學發光和多色熒光成像系統(FluorChem M)，由美國ProteinSimple公司生產；水平電泳槽、電泳儀(型號為BG-MIDI)，均由北京百晶生物技術有限公司生產；隔水式電熱恒溫培養箱(型號為GRP-9080)，上海培因實驗儀器有限公司生產；恒溫搖床(型號為ZWY-240)，太倉市科教器材廠華利達實驗設備公司生產。

2 方法

2.1 引物的設計 從NCBI上查找目的基因mRNA序列，由于沒有番鴨序列，所以根據綠頭鴨Viperin (登錄號為KP198582.1) mRNA序列設計克隆引物1對，在5′端和3′端分別引入EcoRⅠ(GAATTC)和BamHⅠ(GGATCC) 酶切位點；再設計RT-PCR 引物1對。根據MDRV的結構蛋白P10 (登錄號為 EF547375.1) mRNA 序列設計RT-PCR引物1對。根據人GAPDH (登錄號為KJ891221.1) mRNA 序列設計RT-PCR 引物1對。根據番鴨actin(登錄號為 KY352479.1) mRNA序列設計RT-PCR 引物1對。

設計的引物序列見表1。

表1 引物序列信息

h：人源引物 ； d：鴨源引物

2.2 番鴨Viperin 編碼區序列的PCR擴增 從番鴨脾臟中提取總RNA，然后反轉錄獲得cDNA。以此cDNA 為模板，PCR擴增Viperin編碼區序列。PCR反應條件: 95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30 個循環；72 ℃再延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，回收目的條帶。

2.3 真核表達載體的構建 將PCR擴增獲得的Viperin基因和pFlag-CMV-5a 載體分別經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后純化、回收，再用T4 DNA 連接酶將目的片段和載體的雙酶切產物在16 ℃條件下連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞，通過瓊脂糖凝膠電泳跑膠篩選重組質粒。

2.4 克隆質粒的鑒定EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切重組質粒，電泳鑒定；并將重組質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將構建成功的含番鴨Viperin基因質粒命名為pFlag-CMV-Viperin。

2.5 真核表達質粒的轉染 待293T 細胞密度為80%～90%時，將舊培養基更換成轉染液( 無血清無雙抗的DMEM培養基)，取3 μg pFlag-CMV-Viperin，加入轉染液中至總體積為50 μL，輕輕混勻；取VigoFect 2μL，加入轉染液中至總體積為50 μL，輕輕混勻，室溫放置5 min；將含有VigoFect的轉染液逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻，室溫放置20 min；將混合液逐滴加入細胞中，輕輕搖勻，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h后更換成完全培養基，繼續培養24 h，獲得過表達Viperin和空載體pFlag-CMV-5a的293T細胞。這兩種細胞感染同劑量的MDRV(MOI為1)，收集感染24 h后的細胞，提取RNA，反轉錄獲得cDNA，用RT-PCR和qRT-PCR檢測細胞中Viperin的表達量和病毒基因P10的表達水平。

2.6 RT-PCR檢測Viperin基因的表達 提取細胞/組織RNA，并反轉錄獲得cDNA。以此cDNA 為模板，PCR擴增Viperin、P10和GAPDH /actin基因。PCR反應條件為：9 5℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環，72 ℃再延伸10 min。以Actin為內參基因，1.2%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，觀察目的條帶的灰度值，進而分析判斷目的基因mRNA 的表達情況。

2.7 Western-Blot檢測Viperin蛋白的表達 收獲細胞后提取細胞總蛋白。10% SDS-PAGE電泳分離目的蛋白并轉膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗用1×TBS 適當稀釋，室溫下搖動孵育2～4 h；二抗用3%脫脂牛奶稀釋，室溫下搖動孵育2～4 h。用1×TBS洗膜3次，10min/次；最后用化學發光顯色液沖洗膜5 min，曝光并分析結果。

3 結果與分析

3.1 MDRV感染能夠誘導Viperin高表達 MDRV感染293T細胞和MDEF細胞，分別感染不同時間后收集細胞樣品，提取RNA，檢測Viperin的變化情況。結果顯示，隨著病毒復制量的增多，Viperin表達量也呈上升的趨勢(圖1A、B)。此外，用MDRV感染5日齡的雛番鴨，總感染時間為4 d，每隔1 d處死番鴨并收取脾臟來檢測病毒P10和Viperin的表達量。結果顯示，番鴨脾臟中Viperin的表達量在MDRV感染后有明顯的升高，與細胞水平一致(圖1C)。由此說明Viperin的表達與MDRV的增殖可能有著一定的關系。

圖1MDRV感染293T、MDEF和番鴨后P10和Viperin表達量

3.2 重組質粒pFlag-CMV-Viperin的構建 為了進一步研究Viperin基因在MDRV感染機體過程中發揮的作用，我們構建了番鴨Viperin基因真核表達質粒：采用RT-PCR方法從番鴨脾臟組織中擴增得到1條長度約為1 000 bp的特異條帶(圖2)，與預期片段大小相符。利用EcoR I 酶和BamH I 酶雙酶切PCR獲得的Viperin基因片段，同時用這2種酶雙酶切pFlag-CMV-5a載體，將回收的基因片段與載體片段連接，轉化后提取質粒，再利用限制性內切酶EcoR I和BamH I對質粒進行雙酶切鑒定，可以獲得預期約1 100 bp大小的目的片段(圖3)。最后，將該質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序得到的質粒基因序列與綠頭鴨Viperin的基因序列相似度為97.12%，說明重組質粒構建成功，將其命名為pFlag-CMV-Viperin。

圖2 番鴨Viperin編碼區序列的PCR擴增

圖3 重組質粒pFlag-CMV-Muscovy-Viperin的酶切鑒定

3.3 重組質粒蛋白表達水平的檢測 由于番鴨鴨胚成纖維細胞無法傳代培養，且原代細胞轉染效率較低，因此選擇在293T模式細胞中檢測番鴨Viperin重組質粒的表達情況。pFlag-CMV-Viperin重組質粒轉染293T細胞24 h后收取細胞制備蛋白樣，Western-Blot 檢測Viperin蛋白表達水平。pFlag-CMV-Viperin帶有Flag標簽，因此一抗采用Flag標簽抗體。結果顯示，pFlag-CMV-Viperin重組質粒能夠在293T細胞中大量表達(圖4) 。

圖4 Viperin 蛋白表達水平的檢測

3.4 番鴨Viperin蛋白具有抗MDRV增殖的作用 基于成功構建了過表達番鴨Viperin的質粒，我們對其在MDRV復制過程中的功能進行了研究。將pFlag-CMV-Viperin和空載體pFlag-CMV-5a分別轉染至293T細胞，24 h后感染MDRV(MOI =1)，感染24 h后收樣，提取總RNA，用RT-PCR和qRT-PCR檢測細胞中病毒P10基因的表達情況。結果表明，轉染pFlag-CMV-Viperin的P10基因表達量明顯低于對照組。因此說明，番鴨Viperin蛋白對MDRV的增殖起到抑制作用(圖5)。

圖5 過表達Viperin抑制了MDRV在293T細胞中的復制

4 討論

番鴨呼腸孤病毒病在福建、廣東和浙江等多個省份暴發，對我國番鴨養殖業造成了重大的經濟損失[15]，研制高效低毒的抗MDRV藥物勢在必行。先天免疫因子Viperin是一種可被干擾素、多種病毒、細菌脂多糖(LPS)等誘導表達的與內質網相關的抗病毒蛋白，具有廣譜抗病毒活性。Viperin在抑制包括DNA和RNA病毒，細菌和寄生蟲在內的廣泛的微生物入侵中扮演著重要角色。

本研究發現番鴨Viperin基因在感染MDRV的細胞和組織中大量表達，為了探明該現象與病毒復制的相關性，我們構建了番鴨Viperin 基因真核表達質粒，對其功能進行了研究。結果發現，番鴨Viperin蛋白在MDRV感染過程中發揮了重要作用：能夠顯著抑制MDRV的復制。后續工作可以聚焦于番鴨Viperin蛋白具體的作用機制及其調控的相關信號通路，以期更加全面地了解番鴨Viperin蛋白抗MDRV的分子機制。這將為闡明MDRV與宿主相互作用機制及病毒的致病機理提供重要科學依據，同時也為新型抗MDRV藥物的研發提供理論參考。