北京港口水產品中非O1/O139群霍亂弧菌MLST分型研究

付溥博， 張 琳， 曾 靜， 張西萌， 魏詠新， 魏海燕， 耿 榮

(1.北京出入境檢驗檢疫局， 北京 朝陽 100026 ； 2.河北出入境檢驗檢疫局， 河北 石家莊 050051)

霍亂弧菌為革蘭陰性菌，是人類霍亂病的病原體。根據霍亂弧菌O抗原的不同，可分為210多種血清型，過去O1和O139型被認為是引起霍亂流行的主要血清型[1]，所以在檢驗霍亂弧菌時，常常檢驗此2種血清型，但隨著研究的深入，人們發現非O1/O139群霍亂弧菌也會導致疾病[2]。非O1/O139群霍亂弧菌是指除O1群霍亂弧菌和O139群霍亂弧菌以外的霍亂弧菌[3]，是一種全世界都有分布的水生性細菌，廣泛存在于自然界的水體中，常常在水體或水產品中檢出。近年來，越來越多的研究表明，散發或局部暴發的腹瀉是由非O1/O139群霍亂弧菌引起的，此類菌群引起了細菌學家們越來越多的關注[4]。

多位點序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)起源于多位點酶凝膠電泳(Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE)[5]，是一種針對微生物群體中緩慢基因位點變異進行分型的方法。此方法較簡單快速，有著較高的分辨率，最主要是其可以通過互聯網實現實驗室間數據的共享與比較，并利于實驗結果的保留，實驗結果可與多年前的數據相比較[6]。此方法正逐漸被認作沙門、耶爾森等細菌分子分型的“金標準”[7]，有部分學者認為此方法是進行流行病學研究最為可靠的工具[8-9],其結果比脈沖場凝膠電泳(PFGE)方法有著更好的分辨率[10]。本研究采用現有的MLST標準程序，對本實驗室保存的67株分離自進出口水產品中的霍亂弧菌進行分析，并匯總MLST數據庫中菌株信息，進行了基因分型和系統進化的分析。

1 材料與方法

1.1 材料 67株霍亂弧菌為本實驗室保存的分離自2007-2011年北京港口進出口水產品中的菌株。所有菌株活化后，經VITEK 2 Compact鑒定符合霍亂弧菌的生化特征，經血清試驗驗證均為非O1非O139血清型。菌株來源見表1。

表1 菌株來源與ST型

1.2 儀器與試劑 PCR儀(美國羅克韋爾自動化公司)；水平式核酸電泳儀和凝膠成像分析儀(美國伯樂生命醫學產品有限公司)。

堿性蛋白胨水(Alkaline Peptone Water ,APW)(北京陸橋生物技術有限責任公司，161207)；熒光PCR用引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(20161018)；7對管家基因引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成(20170108)；TaqDNA聚合酶PCR試劑盒(普洛麥格生物技術有限公司，20170517)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 將保存菌株在APW中培養過夜，取菌懸液1 mL于Eppendorf管中，10 000 r/min離心2 min，棄去上清，加50 μL無菌水，煮沸裂解10 min，冰浴5 min，10 000 r/min離心2 min，上清液即為DNA模板。立即用于PCR擴增或短期保存于-20 ℃。

1.3.2 致病基因的檢測 應用實時熒光PCR檢測菌株的CTX、toxR和hlyA基因，其20 μL體系為：10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，目標菌上游引物、下游引物(10 μmol/L)各1 μL:，探針(10 μmol/L)1 μL，模板50 ng ～100 ng，用滅過菌的雙蒸水補足20 μL。引物探針具體序列見表2。PCR反應條件：50 ℃，2 min； 95 ℃，10 min；95 ℃，15 s； 60 ℃,60 s；40個循環。反應體系為20 μL。具

表2 致病基因檢測用引物探針

1.3.3 MLST目標基因的選擇和引物的設計 選擇霍亂弧菌的adk、gyrB、metE、mdh、pntA、pyrC、purM7對管家基因作為MLST分析基因。PCR 擴增和測序引物引用http://pubmlst.org/vcholerae/info/primers.pdf 網站上發表的PCR引物序列。

1.3.4 PCR 擴增體系與條件 PCR反應50 μL體系包括：雙蒸水38 μL，TaqDNA Polymerase(5 U/μL)1μL，PremixExTaqTM(10×, 含Mg2+) 5 μL,dNTP 1 μL,上游引物、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板DNA 3 μL。PCR反應條件：96 ℃預變性10 min；96 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，30次循環后70 ℃延伸10 min。擴增產物在加入溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠上電泳，后在成像儀的紫外光下觀察擴增效果。

1.3.5 管家基因的測序及序列分析 將條帶單一且位置正確的PCR產物委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測序。將測得序列與NCBI上查詢到的7種管家基因的進行比較，應用軟件DNAStar-MegAlign7.0將測得的序列裁剪到合適的大小。將裁剪好的序列按adk-gyrB-mdh-metE-pntA-purM-pyrC的順序進行拼接，應用軟件DNAStar-SeqMan 7.0 連接為3 215 bp的片段。將所得片段提交至MLST數據庫比對，獲取等位基因譜(Allele profile)和序列型(Sequence types，STs)。若發現新的等位基因及ST，則將新的信息上報至管理員，以獲得等位基因號碼和ST號碼。應用eBURSTv3.0軟件對我實驗室分離菌株的STs和pubmlst上的數據，進行克隆群(Clonal Complex，CC)、組(Groups)和單體(singletons)分析；并應用goeBURST軟件進行分析。

2 結果

2.1 致病基因CTX、toxR、hlyA檢測結果 67株菌株針對CTX、toxR、hlyA3種毒力基因擴增結果均為陰性。

2.2 管家基因擴增結果 所有菌株均擴增出7個管家基因位點的目的片段結果，擴增產物的核酸濃度及純度均符合測序要求。

2.3 霍亂弧菌MLST分型結果 將等位基因譜提交至MLST網站,結果顯示，67株霍亂弧菌可分為62個STs。其中原有STs 2個，新發現STs 60個。其中相同的ST型有ST377 2株，均來源于中國；ST380 3株，均來源于中國；ST383 2株，均來源于泰國；ST388 2株，均來源于中國。原有ST型為ST271、ST338；新發現STs經MLST網站管理員確認編號為ST369～ST428。

2.4 本試驗結果與pubmlst數據庫相比較的eBURST分析結果 由于本試驗用菌株均為非產毒株，基因變異性較大，分布分散(圖1)。用Seqman軟件分別對這些菌株的7對管家基因進行分析，其基因相似度分別為90.4%～100%(adk)、91.8%～100%(gyrB)、88.6%～100%(mdh)、94.0%～100%(metE)、96.6%～100%(pntA)、41.9%～100%(purM)、86.5%～100%(pyrC)，用Mega 7.0 分別對這7對管家基因進行系統發生分析，用Neighbor-Joining(NJ)法繪制進化樹，其中adk、gyrB、mdh、metE、pntA、pyrC基因相似度較接近，結果以adk可以為例見圖2，purM基因差異最大，結果見圖3。以上結果說明這些菌株的管家基因，尤其是purM基因發生了較大的遺傳變異。繼續將pubmlst數據庫中全部霍亂弧菌的STs進行分析，截止到2017年2月，數據庫中霍亂弧菌共有STs 505個，做eBURST分析，本實驗數據與數據庫中數據可歸為7個組別(圖4)。其中明顯成克隆群的CC71-75、CC176-173、CC430，根據Pubmlst數據庫中信息可知，均為產毒株。根據上面數據分組情況，將Pubmlst數據庫中(包括本實驗數據)與本實驗相關的數據做goeBURST分析，共將71個STs歸為7個組別(圖5)，其中方形框為本實驗室結果具體結果為ST-88～ST-8～ST-384，其中菌株來源于中國和澳洲，本試驗結果為ST-384，來源于中國；ST-423～ST-204～ST-294，其中菌株來源于泰國和法國，本試驗結果為ST-423來源于泰國；ST-403～ST-267，其中菌株均來源于中國，本試驗結果為ST-403，來源于中國；ST-411～ST-15，其中菌株來源于中國和澳洲，本試驗結果為ST-411，來源于中國；ST-416～ST-205，其中菌株來源于中國和泰國，本試驗結果為ST-416，來源于中國；ST-338～ST-348，其中菌株來源于中國和非洲，本試驗結果為ST-338，來源于中國；ST-385～ST-326，其中菌株來源于中國和法國，本試驗結果為ST-385，來源于中國。

圖1本試驗STs的eBURST分析結果

注：每個圓點代表一個ST型，上標數字即為其具體的ST型

圖2adk基因的NJ進化樹

圖3purM基因的NJ進化樹

圖4Pubmlst數據庫中STs的eBURST分析結果

圖5Pubmlst數據庫中的相關STsgoeBURST分析結果

3 討論

早期研究認為，霍亂弧菌的致病基因主要為CTX基因，但也有毒力基因陰性卻引發腹瀉暴發的病例[11]。近年來，越來越多的研究表明，散發或局部暴發的腹瀉是由非O1/O139群霍亂弧菌引起的，此類菌群引起了科研人員越來越多的關注[4]，研究人員發現，非O1/O139群霍亂弧菌相比O1、O139群霍亂弧菌的菌體多糖分泌的變異，使得前者能形成生物膜，從而能更好的抵御不良環境，更適于在其在水產品中生存與繁殖[12]，而在外界某些條件的作用下非O1/O139群霍亂弧菌會通過抗原漂移來獲得毒力基因[13]。故此只有對霍亂弧菌的分子分型進行深入的研究，才能了解該細菌的分型特征及進化、以及溯源情況，并避免產品間或實驗室內的相互污染。

本試驗共從非O1/O139群霍亂弧菌中新發現了60個STs，通過對結果應用eBURST、Paup4.0和goeBURST軟件進行分析可以看出，本試驗的菌株沒有成組，均為單體，將本實驗的ST結果與Pubmlst數據庫中相關的ST一起進行MLST分析，本次試驗的結果也并沒有與數據庫中數據成群的ST型，形成7組，這與本實驗室樣品來源較廣，菌株分離自世界各地的水產品有關。而且，本試驗菌株均為非產毒株，也說明環境非產毒株基因的變化要大于產毒株，此結論與此前有學者報道的“非產毒性霍亂弧菌基因組間差異較大”相符[1]。

應用MLST方法對霍亂弧菌進行研究是較新興的項目，自2013年4月29日開始建立霍亂弧菌的數據庫，迄今此數據庫中數據尚不夠完善，對分組造成了較大影響。在Pubmlst霍亂弧菌數據庫建立之前，有學者對霍亂弧菌進行MLST分析時，選取了與現數據庫不同的管家基因，據報道共涉及了管家基因40個[14]，從而導致了無法與很多早些時候的學者們研究成果相比較，也說明了充分豐富這種全球數據庫的重要性。

從本次試驗結果來看，具有相同ST型的菌株均來源于相同國家，這說明MLST方法擅長于顯示不同地理區域的菌株的進化關系，此方法可以建立一個可靠的食品污染溯源體系，也說明進化有一定的地域性；而成組的ST型則來源于中國、泰國、澳洲、非洲和法國，說明不同地理來源的菌株也可能有著類似的克隆株，說明隨著國際貿易的日益發展，不同大洲之間的細菌正發生著基因的水平轉移。

但在對Pubmlst數據庫中的霍亂弧菌進行研究時發現，霍亂弧菌沒有像其他致病菌那樣，產不同毒素的菌株或不同血清型會明顯成不同群。有學者就曾報道，由于霍亂弧菌產毒菌株的高度克隆化，使得MLST方法對其致病血清的分析效果并不理想[15]，這也是今后研究中值得注意并要解決的問題。

總之，本試驗利用MLST這種操作簡單、易于保存數據，便于比較不同實驗室間的結果，擅長于顯示不同地理區域的菌株的進化關系分子方法，對保存的67株霍亂弧菌進行了分子特征的分析，發現了新的ST型，并向Pubmlst數據庫上傳了數據，擴充了數據庫。通過分析，發現本次試驗數據的克隆組，主要來源于不同國家，有遺傳多樣性；進境水產品中分離菌株多為單體，但相同ST型來源地一致。