河南安陽地區鴨疫里默菌病病原的分離與鑒定及流行病學調查

王慶云， 王會英， 趙 琳， 郭希萍

(安陽市動物疫病預防控制中心， 河南 安陽 455000)

鴨疫里默菌(Riemerellaanatipestifer,R.anatipestifer)是革蘭陰性桿狀菌，屬于黃桿菌屬rRNA超家族V，可感染多種家養和野生水禽，傳播快、病情重、死亡率高，是全球禽類疾病防治工作者共同關注的重大疾病之一。鴨疫里默菌病常見臨床表現為精神委靡、縮頸垂翅、腹瀉、頭頸震顫，病理可見纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎。5周齡以下雛鴨通常在出現臨床表現1～2 d后死亡，周齡較長者疾病慢性化和局限化的可能性較高。但幸存鴨遺留生長緩慢、體重輕等后遺癥，失去飼養價值。

截至目前，全球已發現20種鴨疫里默菌血清型，導致了同種疾病在不同地區的不同疫情特點。因此，對于該病的防治，首要任務就是摸清該病在局部地區的流行病學特點以及當地流行菌株的血清型和抗藥性。

本試驗旨在探究河南省安陽地區鴨疫里默菌病的危害情況和發生規律，確定當地流行株的血清型和抗藥性，為安陽地區的鴨疫里默菌病的防治工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源與收集 于2014年1月至2016年1月，在安陽地區文峰、北關等8個縣市進行了大規模的鴨疫里默菌病流行病學調查。本研究收檢54個鴨場中發生漿膜炎病變的死鴨或同群病鴨，共計117羽，并逐一進行尸體剖檢，無菌采取腦、肝病料進行檢驗。

1.2 病原分離與鑒定 取無菌采取腦和肝病料，接種環取樣劃線接種于巧克力瓊脂培養基和麥康凱培養基，于燭缸中37 ℃培養48 h。觀察菌落生長情況，挑取只在巧克力瓊脂培養基生長、不在麥康凱培養基生長的圓形光滑、半透明、稍凸起菌落，再次進行巧克力培養基純培養，對純培養物進行進一步細菌鑒定。同時挑取在巧克力瓊脂培養基和麥康凱培養基上均有生長的紅色小菌落，進一步純培養并鑒定。

1.3 細菌染色與鏡檢 挑取2次純培養后的菌落，涂片，革蘭染色鏡檢。

1.4 細菌生化試驗 對分離出的二次培養純培養物進行生化檢驗，于37 ℃孵箱培養72 h。檢驗項目包括糖類(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、菊糖)、醇類(山梨醇、甘露醇、肌醇)、明膠、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽和吲哚試驗。每日觀察并記錄結果。

1.5 PCR試驗 樣本DNA提取采用SDS-Protein K法，經紫外分光光度計計算核酸含量后稀釋至0.1μg/μL，進行R.anatipestifer核酸PCR檢測。分離菌株的質粒抽提及PCR擴增采用Tsai等報道的方法[3]。采用菌株RA0511進行氯霉素抗性決定因素分析和質粒測序。針對鴨疫里默菌16S rRNA序列設計引物，上下游引物序列分別為：5′-ATGAAAAATTTCTTCGAA-3′， 5′-TCATTTCATTTTTCTAAA-3′。PCR反應體系包含1X超高溫耐熱DNA聚合酶反應Buffer，50 μmol/μL dNTP，上、下游引物各400 μmol/μL，0.25 U超高溫耐熱DNA聚合酶。擴增條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s共35個循環，42 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，最終72 ℃延伸7 min。采用PTC-100可編程PCR儀。取5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(80 V，60 min)，采用溴化乙錠染色，紫外照射，分析擴增產物。

1.6 血清型鑒定 采用玻片凝集試驗進行血清學鑒定，將待鑒定的細菌分離菌株與R.anatipestifer的單因子血清進行玻片凝集試驗，鑒定其血清型[1]。

1.7 藥敏試驗 取53株分離的R.anatipestifer菌株進行16種抗生素的藥敏試驗。藥物反應為不敏感、低敏、中敏、高敏，抑菌圈直徑分別為：0～0.5 mm，0.5～14 mm，15～20 mm，≥20 mm。

1.8 動物致病性試驗 取60羽未接種疫苗的15日齡北京鴨雛鴨(購自安陽市某鴨苗孵育廠)，隨機分為4組，每組15只。試驗組分別接種本研究病料中分離的R.anatipestifer菌株單獨腹腔注射、大腸桿菌(E.coli)、單獨腹腔注射、R.anatipestifer和E.coli混合腹腔注射(0.5 mL/羽，菌液濃度25×1012CFU/mL)。對照采用生理鹽水腹腔注射(0.5 mL/羽)。相同條件、分開飼養30 d，觀察并記錄患病情況和死亡情況。

2 結果

2.1 細菌分離株來源情況及數量 采集文峰、北關、殷都等8個縣市共54個鴨場發生傳染性漿膜炎的死鴨和/或同群病鴨共117羽。從病料中分離出只在巧克力瓊脂培養基生長、不在麥康凱培養基生長的R.anatipestifer菌株共53株，分離出在麥康凱培養基上生長的E.coli菌株共24株，各地病原流行分布情況見表1。

表1 細菌分離株來源情況及數量

2.2R.anatipestifer分離菌株的生化反應結果 所有R.anatipestifer菌株(53株)均可分解鳥氨酸脫羧酶(53/53,100%)和精氨酸雙水解酶(53/53,100%)。53株RA菌中有49株(92.5%)可液化明膠。所有R.anatipestifer菌株均不能發酵糖類，硝酸鹽還原試驗也均為陰性(見表2)。R.anatipestifer分離菌株的生化反應結果基本符合R.anatipestifer特征。

表2 R.anatipestifer分離菌株的生化反應結果

2.3R.anatipestifer分離菌株的PCR檢測結果 經PCR擴增，分離出的共計53株R.anatipestifer菌株均可擴增出目的條帶；同方法、同條件PCR擴增后，分離出的共計24株E.coli菌株均未產生目的條帶(見表3)。R.anatipestifer菌株擴增后的目的條帶為654 bp，見圖1。

表3 分離菌株的PCR檢測結果

圖1 PCR方法檢測R.anatipestifer分離株及對照菌株

M：Marker； 1-9：R.anatipestifer； E：E.coli

2.4R.anatipestifer菌株血清型鑒定結果 分離得到的53株RA菌株血清型鑒定結果均符合RA血清1型，24株E.coli菌株血清鑒定結果均為陰性反應。

2.5R.anatipestifer分離菌株的耐藥性分析 53株R.anatipestifer菌株中，絕大多數對氯霉素(51/53)、呋喃妥因(46/53)、慶大霉素(42/53)耐藥，超半數菌株對萬古霉素耐藥(29/53)。超半數菌株對青霉素(42/53)、諾氟沙星(42/53) 、氨芐青霉素(39/53)中敏。超半數菌株對頭孢氨芐(43/53)、頭孢拉定(38/53)和四環素(36/53)高敏。

2.6 雛鴨分離菌致病性試驗結果R.anatipestifer菌液單獨注射組雛鴨發病率為86.7%，死亡率為73.3%；E.coli菌液單獨注射組雛鴨發病率為73.3%，死亡率為60.0%；R.anatipestifer+E.coli混合菌液注射組雛鴨發病率為100.0%，死亡率為86.6%。三組病鴨/死鴨剖檢均可見心包炎、肝周炎和氣囊炎的典型“三炎”病變。生理鹽水注射對照組發病率和死亡率均為0%。

表4 R.anatipestifer菌株耐藥性分析

-：不敏感；+：低敏；++：中敏； +++：高敏

表5 15日齡雛鴨接種分離菌后死亡情況

3 討論

本試驗對河南省安陽地區8個縣市的鴨疫里默菌病進行了大規模流行病學調查，對54個鴨場進行了收集采樣，采集得病/死鴨共計117羽，分離得到R.anatipestifer菌株共計53株，分離率達45.3%。對分離得到的所有菌株進行生化檢驗表明，菌株符合R.anatipestifer特征。通過本試驗可見，鴨疫里默菌病是安陽地區的重要流行病，對該病的防治工作不容忽視。

截止目前，全球范圍內報道的R.anatipestifer血清型共計20種。以往我國其他地域的鴨疫里默菌流行株調查研究顯示，北京地區逐漸出現8個以上血清型、江蘇地區出現5個以上血清型的鴨疫里默菌。[2]不同血清型菌株的防治各有不同，因此對局部地區菌株血清型的監測十分重要。在本研究發現，安陽地區流行的鴨疫里默菌血清型均為1型，為本地區鴨疫里默菌病的防治提供了科學依據。

本研究對53株菌株進行了包含青霉素類、喹諾酮類、大環內酯類的16種抗生素進行藥敏試驗，發現安陽地區流行株對四環素、頭孢氨芐和頭孢拉定高度敏感；對氯霉素、呋喃妥因、紅霉素和慶大霉素耐藥。該研究結果對本地區鴨疫里默菌病的治療有重要指導作用。

從本地分離菌株的雛鴨致病試驗可知，本地鴨疫里默菌菌株的致病力強，死亡率高；且與大腸桿菌的混合致病也很常見，致病力和死亡率均高于鴨疫里默菌單菌種致病。因此，鴨禽養殖戶需要加強鴨舍墊料清潔，改善鴨舍環境，預防鴨疫里默菌病。