2012-2017年我國雞傳染性鼻炎流行態(tài)勢分析

龔玉梅， 張淑瓊， 李淑芳 ， 梅 晨， 侯 婷， 王宏俊 ， 張培君

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 海淀 100097 ； 2.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司,廣東 肇慶 526238 ；3.北京市延慶區(qū)農(nóng)業(yè)局， 北京 延慶 102100)

雞傳染性鼻炎(IC)是由副雞禽桿菌[(Avibacteriumparagallinarum，A.paragallinarum)，2005年以前稱副雞嗜血桿菌(H.paragallinarum)]引起的雞的一種急性或亞急性呼吸道傳染病[1]。IC的臨床癥狀表現(xiàn)為流鼻汁、流淚、眶下竇腫脹，排白色或綠色糞便[1]。IC造成的最大經(jīng)濟損失是產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降(10%～40%)和育成雞生長不良[1]。Page采用傳統(tǒng)血凝抑制(HI)試驗將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個血清型[1]，我國于1986年由馮文達在北京首次分離到副雞禽桿菌[2-3]，經(jīng)鑒定為Page A型；1995年林毅等報道了Page C型副雞禽桿菌分離株[4]；2003年，張培君等在大連分離到1株副雞禽桿菌，經(jīng)鑒定為Page B型[5]。確診IC，目前國際上所使用的金標(biāo)是陳小玲等建立的種特異性PCR[6]。2012年，日本學(xué)者Ryuichi S等建立了副雞禽桿菌型特異性PCR診斷方法[7]。

2012-2017年，北京、山東、安徽、貴州、河北和廣西的大中型養(yǎng)殖企業(yè)，發(fā)生疑似雞傳染性鼻炎的病例，表現(xiàn)為產(chǎn)蛋明顯下降，眶下竇腫脹、流鼻汁，送疑似病料共計125份到本實驗室進行診斷。診斷情況和流行態(tài)勢分析報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料 來源于北京、山東、安徽、貴州、河北和廣西的大中型養(yǎng)殖企業(yè)。北京為直接送檢，其他省市區(qū)取病雞雞頭加冰塊包裝后快遞至本實驗室。2012～2017年共計送來125份病料。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 0083(Page A型)、0222(Page B型)和Modesto(Page C型)，由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Pat Blackall教授惠贈，保存在本實驗室。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 用0083(Page A型)、0222(Page B型)和Modesto(Page C型)制備的高免兔血清，由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Pat Blackall教授惠贈，保存在本實驗室。

1.4 培養(yǎng)基 雞血清雞肉湯瓊脂和半合成培養(yǎng)基，參照馮文達等的方法制備[2]。

1.5 PCR引物 參考陳小玲等設(shè)計的種特異性PCR引物[6]和Ryuichi S等設(shè)計的型特異性PCR引物[7]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR緩沖液、dNTP、Taq聚合酶、DNA Marker等購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.6 方法

1.6.1 細(xì)菌分離 將病雞頭放在超凈工作臺或者生物安全柜內(nèi)，用燒紅的刀片燒烙眶下竇外表面2～3次，用無菌刀片切開眶下竇，用高壓過的棉拭子沾取眶下竇內(nèi)容物，在含NAD的雞血清雞肉湯瓊脂平皿上劃線，將平皿放在5%CO237 ℃培養(yǎng)16～18 h[2]。

1.6.2 DNA提取 參照龔玉梅等的方法提取DNA[8]。簡單地講：從單個可疑菌落擴大培養(yǎng)16～18 h的平皿上隨機挑取5～6個菌落，放入100L無菌去離子水中，98 ℃熱處理10 min后，13 000r/min離心5 min，上清液即為模板DNA。

1.6.3 PCR 參照陳小玲等的方法[6]，進行種特異性PCR檢測。參照Ryuichi S等的方法[7]，進行型特異性PCR檢測。

1.6.4 血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI) 參照Pat Blackall教授實驗室(雞傳染性鼻炎國際參考實驗室)的方法進行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 從125份送檢樣品中， 獲得疑似副雞禽桿菌66株。

2.2 種特異性PCR和型特異性PCR 將獲得的66株疑似副雞禽桿菌擴大培養(yǎng)后，提取DNA，進行種特異性PCR和型特異性PCR。結(jié)果見表1。部分樣品的PCR結(jié)果見圖1～4。

表1 125份送檢樣品細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

n：沒有進行

2.3 血清學(xué)分型 隨機取廣西2015年分離株和貴州2016年分離株各2株、北京2014年分離株2株，參照Pat Blackall教授實驗室(雞傳染性鼻炎國際參考實驗室)制定的Page方法(未公開發(fā)表)，制備成全細(xì)胞抗原，用此抗原進行HA和HI試驗。結(jié)果見表2。

圖1 2016年貴州樣品種特異性PCR結(jié)果

M:DL-2 000; 1～8:貴州某企業(yè)2016年送檢樣品；9:陽性對照； 10:陰性對照

圖2 2016年貴州樣品型特異性PCR結(jié)果

M:DL-5 000; 1～8:貴州某企業(yè)2016年送檢樣品； 9:A型標(biāo)準(zhǔn)株；10:B型標(biāo)準(zhǔn)株； 11：C型標(biāo)準(zhǔn)株； 12：陰性對照

圖3 廣西和北京分離株型特異性離株 PCR結(jié)果

A:DL-5 000 Marker; 1～6：廣西2015年分離株； 7～8：北京2014年分離株9: A型標(biāo)準(zhǔn)株； 10: B型標(biāo)準(zhǔn)株； 11: C型標(biāo)準(zhǔn)株； 12; 陰性對照

圖4 廣西和北京分離株種特異性離株 PCR結(jié)果

B:DL-2 000 Marker; 1～6：廣西2015年分離株 ；7～8：北京2014年分離株； 9: A型標(biāo)準(zhǔn)株； 10: 陰性對照

3 討論

3.1 陳小玲等建立的雞傳染性鼻炎PCR診斷方法[6]，特異性為100%，敏感性為可檢出1 pg DNA，重復(fù)性好，被國際禽病界公認(rèn)為IC診斷金標(biāo)，被我國農(nóng)業(yè)部認(rèn)定為農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T538-2002)。日本學(xué)者Ryuichi S等建立的型特異性方法[7]，由于建立方法時，所檢驗的菌株數(shù)量相對有限，故其他學(xué)者重復(fù)此方法時，極少部分菌株的檢測結(jié)果與經(jīng)典的血清學(xué)方法檢測結(jié)果存在差異。盡管如此，由于其快速、重復(fù)性好，因此其檢測結(jié)果可以作為參考。

表2 Page方法的HI分型結(jié)果

++++：100%凝集抑制； +++：75%凝集抑制； -：100%凝集； *：兩個分離株結(jié)果相同

3.2 近6年來，北京、山東、安徽、貴州、河北和廣西等省市區(qū)共送檢雞傳染性鼻炎疑似病料125份，分離到疑似副雞禽桿菌66株，種特異性PCR確定其中45株為副雞禽桿菌。型特異性PCR確定45株副雞禽桿菌分離株中，A型為15株，B型為30株。暫沒有檢測到C型分離株。

3.3 隨機取廣西2015年分離株、貴州2016年分離株各2株和北京2014年2個分離株，分別制備抗原，再與標(biāo)準(zhǔn)A型、B型和C型陽性血清進行HI試驗，結(jié)果表明，2個廣西分離株和2個北京分離株均為Page B型，2個貴州分離株均為Page A型。與型特異性PCR結(jié)果完全一致。

3.4 從125份可疑病料中分離到副雞禽桿菌45株，分離率為36%。不排除其他80份樣品中也存在副雞禽桿菌，可能被生長快速的雜菌掩蓋；或者在運輸過程中因為時間過長而失活。

3.5 45株副雞禽桿菌分離株中，B型為30株，占66.7%；A型為15株，占33.3%，暫時沒有檢測到C型。再次表明，我國近幾年的雞傳染性鼻炎以B型為主[8-10]。此結(jié)果再次提示，給產(chǎn)蛋雞只免疫利用國內(nèi)分離株研制的三價滅活疫苗[11-12]迫在眉睫。