側腦室注射EGb 761對MCAO大鼠神經細胞凋亡的影響※

孫靈芝 孟苗苗 劉 芹 曹曉嵐

（1 山東中醫藥大學附屬醫院腦病科，山東 濟南 250011；2 山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250014；3 山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東 濟南 250014)

目前，缺血性腦卒中具有較高的發病率和致殘率，卻缺乏有效的治療措施。溶栓治療是循證醫學證實有效的療法，因時間窗的限制而難以使大部分患者獲益。

近年來，人們認識到缺血-再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要損傷機制，而細胞凋亡又是缺血-再灌注損傷的重要發病環節。腦梗死時，梗死中心區域的神經元因嚴重缺血而導致早期壞死，而周圍半暗帶的神經元則發生遲發性凋亡。c-fos基因屬于即早基因家族，能在受到外界刺激后10～30 min內，轉錄形成mRNA。腦內正常水平的c-fos基因表達有一定保護作用，過度表達的Fos蛋白則會轉入細胞核內與c-jun基因的表達產物Jun蛋白結合生成異源二聚體，作用于轉錄環節，可引起細胞凋亡[1-2]。

我們采用側腦室注射技術，觀察EGb 761對大腦中動脈缺血-再灌注大鼠皮層區梗死灶周圍凋亡細胞、fos、c-jun基因表達，探討其作用機制，及側腦室注射技術的可行性。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雌性SD大鼠，體質量（250±20）g。購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005，SPF級環境適應性飼養7 d。

1.2 藥品和試劑 EGB 761（7320400，German Weimar Dr.Shu Pei pharmaceutical factory， Inc)；10%水合氯醛，魯藥準字再H01080291，產品批號：20110601；0.9%氯化鈉注射液，250 mL，山東金洋藥業有限公司，國藥準字H37021678，產品批號12.95412；兔抗c-fos、c-jun抗體（北京中杉生物有限公司）；DAB顯色液（京博奧森生物工程有限公司）；TUNEL試劑盒 (Roche，Germany)，Mouse polyclonal to Brdu (Santa Cruz biotechnology， Inc)，工作濃度：1∶100；Mouse polyclonal to NCAM (Merck Millipore)，工作濃度：1∶100；Goat anti Mouse IgG-FITC (Santa Cruz biotechnology，inc)，工作濃度為1∶100。正常羊血清封閉液 (福州邁新生物技術開發有限公司)。檸檬酸抗原修復液 (PH6.0)(福州邁新生物技術有限公司)。PBS檸檬酸緩沖液(PH7.4) (福州邁新生物技術有限公司)。防脫片劑：0.1%多聚賴氨酸 (北京中杉金橋生物技術有限公司)。光學顯微鏡（德國leicaDM4000B）；leica Qwin V3圖像分析軟件（德國）。

1.3 分組、模型制備及神經功能評分 將大鼠隨機分為注模型組、治療組及假手術組，每組10只。5只用于TUNEL檢測，5只用于C-FOS、C-JUN檢測。用插線法制備大腦中動脈阻斷的缺血再灌注模型[3]。大鼠10%水合醛麻醉后，沿頸正中切開，仔細分離右側頸內外動脈 (ICA，ECA)，將ECA結扎并剪斷，拉直與ICA成一直線，將一根長4.0 cm，直徑0.26 cm的圓頭硅化尼龍線由ECA插入ICA1.85～2.00 cm，進顱至大腦中動脈起始處，而假手術組僅插入9 mm。缺血2 h后小心抽出尼龍線，結扎ECA開口處，縫合切口后放回籠中。再灌注2 h后處死動物。選取評分為1～2分的大鼠為模型鼠，進行后續的檢測。待大鼠術畢清醒后，參照Zea Longa分制法[4]進行神經功能缺損評分:0分:無神經功能缺損癥狀；1分:提尾倒掛時左前肢緊貼胸壁不能伸展；2分:行走時向左側轉圈；3分:行走或站立時向左側傾倒；4分:意識障礙，不能行走。選取1～3分者進行后面的連續檢測。

1.4 給藥方法 腦缺血后即時給予側腦室注射EGb 761或等量生理鹽水。用10%的水合氯醛 (0.3 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，矢狀突切開頭皮至顱骨，參照Paxinos-Watson圖譜，以前囟為基點，后移3.5 mm，右移3.5 mm鉆開顱骨，以顱骨表面為準垂直進針3.8 mm，用微量注射器將0.525 mg/kg EGb 761(0.1 mL/h)注入側腦室，注射結束后留針10 min，再撤出微量注射器，骨蠟封閉小孔，常規局部消毒、縫合切口，麻醉管理，待蘇醒[5]。

1.5 取材及組織切片樣本制備 腹腔注射10%水合氯醛（0.06 mL/kg）麻醉大鼠，暴露心臟，穿刺左心室，插管入升主動脈，剪開右心耳，以250 mL生理鹽水快速灌注至肝臟變白，以含4%多聚甲醛的PBS（0.1 mol/L，pH7.4）灌注固定，0.5 h后取出全腦，置入4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS（pH7.4，4℃） 后固定；8 h后放置于含20%蔗糖的磷酸緩沖液中，待腦組織下沉，進行冰凍切片；根據大鼠腦組織立體定位解剖圖譜，將腦組織切成厚30 μm的切片，用于c-fos、c-jun、TUNEL。

1.6 細胞凋亡檢測 采用原位末端標記法 (TUNEL)檢測細胞凋亡，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行，細胞核染色呈紫褐色者視為TUNEL染色陽性神經元。選取腦額頂部皮層部位，200倍光鏡下計數5個視野陽性細胞數目，求其平均值。

c-fos、c-jun檢測：將腦片置于37℃正常羊血清工作液封閉，中孵育1 h，滴加一抗4℃冰箱孵育過夜；轉至室溫平衡30 min，PBS沖洗3×10 min；滴加熒光二抗，37 ℃避光孵育60 min，PBS沖洗4×10 min；DAB顯色，復染；梯度酒精脫水；二甲苯透明2次，中性樹膠封片[6]。光鏡下，陽性細胞細胞核染色體呈現棕黃色，多為圓形或者卵圓形。各組大鼠每張腦片隨機選取5個視野，分別對c-fos、c-jun陽性細胞進行計數并利用leica Qwin V3圖像分析軟件分析其平均灰度。

1.7 統計學方法 用SPSS 22.0進行統計學處理，采用單因素方差分析，結果用（±s）表示。

2 結果

2.1 神經行為學觀察 術后2 h左右大鼠清醒時進行評分，分值越高，動物行為障礙越嚴重。有以下癥狀：畫圈運動，站立不穩，左側傾倒，不能完全伸展左側前爪，經統計分析，除假手術組外無明顯缺血行為表現外，其余各組均表現為神經行為學異常。

2.2 對缺血-再灌注大鼠皮層區梗死灶周圍TUNEL陽性細胞計數的影響 各組不同時間點均有TUNEL陽性表達細胞。凋亡細胞胞核呈紫褐色著色，胞核固縮，顆粒深染，呈橢圓形、圓形及不規則形。假手術組第7天，第14天均有少量陽性細胞。與假手術組相比，模型組第7天，14天大鼠區TUNEL陽性細胞數均明顯增多 (P＜0.05)，第7天更為顯著，提示MCAO可引起梗死灶周圍神經細胞凋亡；在各時間點，與模型組比較，治療組陽性細胞數明顯減少，差異有統計學意義 (P＜0.05)，提示治療組大鼠海馬區神經元調亡減少 (圖1)。第14天，模型組及治療組凋亡細胞數均有下降。

圖1 缺血再灌注大鼠腦組織皮層梗死周邊區TUNEL陽性細胞表達(×200)

假手術組、模型組和治療組TUNEL陽性細胞：圖1是對TUNEL陽性細胞的定量分析。模型組TUNEL陽性細胞較假手術組明顯增多（P＜0.01），治療組TUNEL陽性細胞較模型對照組明顯減少（P＜0.05）。

2.3 對缺血-再灌注大鼠皮層區梗死灶周圍c-fos和cjun陽性細胞數的影響 鏡下c-fos、c-jun基因蛋白染色呈棕褐 (黃)色。假手術組僅見少量陽性細胞，模型組大鼠腦神經元、神經膠質內c-fos和c-jun陽性細胞數較假手術組明顯增多（P＜0.01），治療組c-fos和 c-jun陽性細胞數較模型組顯著減少（P＜0.05），提示缺血-再灌注大鼠模型可顯著提高c-fos和c-jun陽性細胞數，EGb 761對c-fos和c-jun陽性細胞數有抑制作用。

假手術組、模型組和治療組c-fos、c-jun陽性神經細胞：圖2A、2B是對c-fos、c-jun陽性細胞的定量分析。模型組c-fos、c-jun陽性神經細胞較假手術組明顯增多（P＜0.01），治療組c-fos、c-jun陽性神經細胞較模型組明顯減少 （P＜0.05）。

3 討論

腦缺血后即早基因的表達變化，與缺血后組織損傷、修復及神經網絡的重建有關，其表達上調或下調可用于評價腦缺血的干預措施的有效性。Dragunow[7]研究發現，中度缺血缺氧可引起缺血側神經元c-fos、cjun的快速誘導，且與遲發性選擇性神經元死亡有關。蔣犁等[8]采用逆轉錄擴增、免疫組化和Tunel標記方法，在轉錄和翻譯水平分析c-fos基因表達與腦海馬遲發性神經細胞死亡的相關性。結果發現，缺氧缺血后腦海馬c-fos mRNA即刻出現表達，至1 h左右達高峰，2 h后表達回落近基礎水平；而對照組則無相應的表達曲線；c-fos蛋白表達較c-fos mRNA表達高峰時間遲約1 h，并持續于高水平。提示新生腦的神經元對損傷刺激不僅敏感，而且具有一定的耐受性。李一欣等[9]對新生大鼠腦缺血缺氧再灌注后不同時間段海馬CA1、CA3區c-jun基因表達和凋亡細胞進行檢測，發現缺血缺氧再灌注3、6、12、24、48、96 h后c-jun基因表達和凋亡細胞均高于對照組，6 h達高峰，7 d時與對照組無顯著差異，提示c-Jun可能與輕度缺血缺氧再灌注后神經元的凋亡與修復有關。Yamaguchi[10]發現，腦缺血再灌注1～48 h內，大鼠腦內c-fos和c-jun的mRNA表達增高，而這種增高可被環孢菌素A明顯抑制。董勁松等[11]發現，局灶性腦缺血可以引起c-fos在缺血側腦區的廣泛大量表達，而這種表達可被電針部分抑制，同時可見局灶性腦缺血動物模型的腦梗死灶體積減小；但腦內注射cfos反義寡核苷酸阻斷c-fos表達，可導致腦梗死灶體積明顯增大，提示腦內c-fos的過度表達是腦缺血損傷的機制之一，但其適度的表達，可能在腦缺血損傷中有一定的保護作用。

圖2 c-fos、c-jun表達陽性神經元及神經膠質細胞（SP染色，×400）

腦缺血-再灌注損傷后，神經元和神經膠質細胞內均可見c-fos和c-jun表達，且其表達可受細胞內信號通路如神經生長因子 (nerve growth factor，NGF)、表皮生長因子 (epidermatic growth factor， EGF)、成纖維細胞生長因子 (fibroblast growth factor，FGF)和白細胞介素-6 (interleukin 6，IL-6)等誘導，參與神經突觸可塑性的調節[12-15]。

EGb 761是銀杏葉的提取物，含有多種相互作用的有效成分 (如黃酮糖苷、銀杏苦內酯、白果內酯、先期花色素及少量酚酸)，具有多價性的藥理學作用。研究證實，EGb 761抗氧化、清除自由基，抗缺血引起的細胞凋亡等作用[16-19]。由于血腦屏障僅允許脂溶性小分子物質有效透過，限制了許多藥物療效的發揮，近幾年作為一種系統性用藥技術，側腦室注射技術可提高治療的靶向性，有效提高損傷局部血藥濃度，被越來越多地應用于實驗研究，并獲得了良好的效果[20-22]。EGb 761具有水溶性和脂溶性雙重特性，分子量較大，只能部分透過血腦屏障，因此，我們采用側腦室注射技術以提高其缺血-再灌注損傷局部血藥濃度，以提高其靶向性療效。

本研究提示，大腦中動脈腦缺血-再灌注模型可引起皮層梗死灶周圍神經細胞凋亡及c-fos、c-jun的過度表達；而側腦室注射EGb-761可抑制細胞凋亡，下調cfos、c-jun的過度表達，上調海馬區內源性神經干細胞的發生，這可能是其抗缺血-再灌注損傷的分子機制之一，為側腦室注射EGb 761用于腦缺血-再灌注損傷的治療提供了理論依據。