蓽茇藥材中蓽茇酰胺高效液相色譜研究※

賈貴清 吳小愚 王玉玨 趙高平*

（1 四川省醫學科學院·四川省人民醫院胃腸外科，成都 610072；2 四川科倫藥業股份有限公司，成都 610072）

蓽茇（Piper Longun L.），系胡椒科（Piperaceae）植物，其常用入藥部位是干燥近成熟或成熟的果穗，味辛大溫，無毒，歸胃、大腸經，具有溫中散寒、下氣止痛之功效，中醫多用于治療泄瀉、偏頭痛及牙痛等，是中、蒙、藏、維醫的習慣用藥，收載于《中國藥典》 (2015年版一部)[1]及《中華人民共和國藥典衛生部藥品標準維吾爾藥分冊》[2]。現代研究表明蓽茇具有抗氧化、抗腫瘤、保護肝臟、抗炎、止痛及免疫調節、降血脂、鎮靜、抗驚厥、抗胃潰瘍、耐缺氧、抗急性心肌缺血、抗心律失常等多種藥理學活性[3-4]，其中蓽茇酰胺是其主要藥理成分，對腫瘤細胞具有顯著細胞毒作用，還具有抗血小板、抗動脈粥樣硬化、抗狼瘡性腎炎、抗帕金森病等作用，表現出抗血小板凝集、抗炎鎮痛、抗真菌等諸多藥理活性[5]，越來越受到人們的關注。

由于中藥不良反應事件不斷被報道，所以中藥安全性已為國內外所關注，對于中藥的質量控制要求更為嚴格[6]。2015版《中國藥典》收載胡椒堿作為蓽茇果實藥材的指標性成分，但蓽茇中的成分較為復雜，為了更準確地控制蓽茇藥材的含量，本文旨在以蓽菝酰胺為指標性成分，以成熟穩定的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 為手段，建立分析方法，用于對不同產地蓽茇藥材及其不同藥用部位進行對比分析，為蓽茇藥材的道地性和質量評價提供更全面可靠的依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀系列，包括：檢測器 (G1365D DAD)，四元梯度泵 (G1311A Quat Pump)，在線真空脫氣機 (G1332A)，自動進樣器 (G1329A ALS)，柱溫箱 (G1316A Colcom)， 工作站 (Agilent Chemstation system) (Agilent Technologies， 美國)；超聲波清洗器，甲醇（HPLC級）、超純水、蓽茇酰胺對照品（上海源葉生物科技有限公司），其余試劑均為分析純。蓽茇藥材分別來自于廣西、廣東、海南、福建、江西，經四川大學華西藥學院何俊博士鑒定為胡椒科植物蓽茇Piper longum L.

2 研究方法

2.1 色譜條件 Agilent 1100， 色譜柱為迪馬Diamond C18， 5μm 250×4.6mm， 流動相甲醇-水 （35∶65）， 流速1 mL·min-1，檢測波長254 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蓽茇酰胺對照品10.35 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為胡椒堿儲備液，依次精密吸取1、2、4、6、8、9 mL分別容于10 mL容量瓶中，加甲醇定容后，即得系列蓽茇酰胺對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蓽茇藥材粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL，浸泡60 min后，超聲提取40 min（150 w/60 KHz），過濾，重復2次，合并濾液，減壓蒸餾揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解定容至25 mL，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下制備的標準溶液20 μL按“2.1”項下中的色譜條件進樣測定。以標準溶液濃度為橫坐標 (X)，峰面積為縱坐標 (Y)進行線性回歸，得回歸方程，記錄峰面積值。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取同一濃度的蓽茇酰胺對照品標準溶液20 μL，在2.1項下色譜條件，連續進樣6次，計算峰面積的相對標準偏差RSD值。

2.3.3 重復性試驗 取同一批次的藥材粉末，按照“2.3.2”項下的方法制備樣品溶液6份，按照“2.1”項下的色譜條件測定，計算峰面積的RSD值。

2.3.4 穩定性試驗 取同一濃度的蓽茇供試品溶液分別在0、1、2、4、8、12、16、24 h進樣測試，計算峰面積的相對標準偏差RSD，了解24 h內試劑穩定性。

2.3.5 加樣回收試驗 分別精密稱取已知蓽茇酰胺含量的蓽茇藥材粉末6份，每份約0.5g。精密稱取蓽茇酰胺對照品20.08 mg，甲醇溶解定容至50 mL，分別精密量取5 mL加入上述粉末中，按照“3”項下的方法制備樣品溶液，并按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。

2.4 蓽茇藥材的含量測定 取不同產地及不同藥用部位的蓽茇藥材粉末按照“3”項下方法制備樣品溶液，每批6個平行樣品，精密吸取20 μL按上述色譜條件進樣測定，并計算含量和RSD值。

3 結果

線性關系考察進樣測定得到回歸方程為A=13587685.5C-48597.12（r=0.9999）， 在 0.0411～0.3835 mg·mL-1濃度范圍內與峰面積具有良好的線性關系，色譜圖見圖1。精密度試驗結果顯示RSD=1.89%（n=6），提示精密度良好。重復性試驗結果表明該法重復性良好，RSD=2.66%。該方法在24 h內穩定性良好，其RSD=2.73%（n=8）。而試驗加樣回收率在98.40%～102.38%，表明試驗方法具有較好的準確度，見表1。不同產地的蓽茇藥材果實及莖中蓽茇酰胺的含量有一定的差異，其中以廣西田林縣蓽茇果實中蓽茇酰胺含量最高，見表2。浦北縣蓽茇莖中蓽茇酰胺含量最高，見表3。

圖1 對照品（A）和供試品（B）液相色譜圖

表1 加樣回收試驗

表2 不同產地的蓽茇果實中的蓽茇酰胺含量 （n=6）

表3 不同產地的蓽茇莖的蓽茇酰胺含量 （n=6）

圖2 蓽茇酰胺

4 討論

蓽茇酰胺又稱蓽茇明堿，其化學名為3、4、5-三甲氧基肉桂酰環己酰胺，分子式為C17H19NO5，結構如圖2。屬于生物堿酰胺類化合物，最初主要從印度南部以東南亞的胡椒科植物蓽茇的根中分離而得，在長柄胡椒 (P.sylvaticumRoxb.)和瘤突胡椒（P.tuberculatum Jacq.）的根中可以分離得到。近年來，大量研究發現蓽茇藥材中主要的藥理作用為蓽茇酰胺，后者具有抗炎、鎮痛、抗抑郁，甚至抗惡性腫瘤等多種藥理活性作用，且對正常的細胞、組織、器官無明顯的毒副作用[4-5，7-8]。2011年Raj等[9]在《Nature》上發表了蓽茇酰胺體外試驗具有選擇性殺傷腫瘤細胞的作用，而對正常組織細胞無明顯影響，并且詳細得出了植物天然成分蓽茇酰胺不依賴p53等抑癌基因的狀態，能明顯降低乳腺癌細胞株、骨肉瘤癌細胞、慢性淋巴細胞白血病/淋巴瘤B細胞等14種不同起源的腫瘤細胞株的活力，其平均半數致死量（IC50）為7 μmol/L，而即使將蓽茇酰胺濃度增加到15 μmol/L也不影響主動脈內皮細胞、乳腺上皮細胞、皮膚成纖維細胞等6種非腫瘤細胞株的活力。同時，研究發現低摩爾濃度的蓽茇酰胺也能抑制EBV非轉染及轉染B淋巴腫瘤細胞的生存平衡，且不傷害正常外周血B淋巴細胞沒有毒性。蓽茇酰胺還可以降低核轉錄因子-κB的活性，下調c-myc的表達，通過影響NF-κB/MYC關鍵靶基因 (如下調MYB、E2F1和上調GADD45B)的表達水平，進而殺傷淋巴腫瘤細胞。此研究也為B細胞惡性腫瘤的治療策略以及其他類型血液癌癥的預防和治療提供新方法[10]。因此，Raj等人的研究再次掀起了對中國傳統藥材蓽茇抗腫瘤的研究熱潮，而目前對蓽茇酰胺的提純與凈化等工序尚無完整、統一的標準。

中藥材成分復雜，一般以其具有生理活性的主要化學成分作為質量評價和質量控制指標，目前在中藥的質量控制方面，傾向于多成分、多指標控制。而以往對于蓽茇的質量控制只采用胡椒堿為單一指標成分。本實驗突破了以往僅采用胡椒堿為指標成分的指標質量控制方法，還研究測定蓽茇中蓽茇明酰胺的含量，為蓽茇藥材多指標質量控制標準的建立提供了依據，也為含此類酰胺類生物堿類成分的其他藥材定量分析提供了參考。常用的測定方法有紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用法、氣相色譜法、核磁共振波普法等[11]，其中HPLC分為分析型和制備型高效液相色譜法兩種，適用于極性、非極性、離子型及高分子化合物的分離與分析，是以經典的液相色譜法為基礎，引入氣相色譜的理論和試驗方法，高壓輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段發展而來，具有分離效能高、分析速度快及應用范圍廣等優點。本研究采用分析型高效液相色譜法，通過對不同檢測波長（200～400 nm）掃描檢測和圖譜分析比較，在250 nm時能檢測到較多的蓽茇酰胺成分峰信息，故選擇250 nm作為檢測波長。查閱有關文獻[1]，對甲醇-水，甲醇-0.2%甲酸，乙腈-水，乙腈-0.2%甲酸不同比例的流動相系統進行等度和梯度洗脫試驗摸索和比較分析，結果表明，甲醇-水（35∶65） 進行梯度洗脫得到的圖譜色譜峰分離度好，基線平穩，保留時間適中，最終確定以甲醇-水一定比例洗脫作為流動相，以254 nm為檢測波長的基本色譜條件，這與徐麗芳[12]應用HPLC測定山香圓葉藥材的方法相似，但采用乙腈-0.5%磷酸水溶液、波長在200～400 nm，未進行波長分析比較。制備型高效液相色譜法的理論與設備基礎目前尚未完善，但是是以分析型為基礎，隨著中藥學科的不斷發展，中藥含量測定的研究也會更加的全面，制備型的高效液相色譜法會表現出更為廣闊的前景。

蓽茇生長在海拔200～1000 m的低谷、河谷和盆地邊緣的濕熱地區，我國國內主產于云南、廣東，北方如河北等地也有生長，國外主產于印度尼西亞、菲律賓、越南等國，不同產地及不同藥用部位的中藥材存在一定的成分差異[13-14]，本研究證實我國廣西田林縣蓽茇果實中蓽茇酰胺含量最高，而安徽亳州市的蓽茇中蓽茇酰胺含量最低，中藥材中各成分含量的高低可能與藥材生長的海拔、緯度、土壤以及日照強度和時間等因素有關。此外，同一株中藥材植物不同藥用部分中成分含量也不盡相同，蓽茇酰胺在果實中含量最高，莖、葉中含量較少，我們的研究也證實了果實中蓽茇酰胺的含量較莖中高。

綜上所述，本研究證實了不同產地及不同藥用部位蓽茇中蓽茇酰胺的含量有所差異，同時建立了一種HPLC測定蓽茇藥材中蓽茇酰胺含量的方法，結果顯示該方法精密度高、穩定性及重復性和加樣回收率等較為理想，提供了一種快速、準確、經濟的測定蓽茇中蓽茇酰胺含量的方法，值得推廣。