天龍組方對腎虛證COPD大鼠肺功能及炎癥因子的作用※

周海祥 趙欽綿 夏鑫華*

（1 江西吉安市中心人民醫院中醫科，江西 吉安 343000；2 廣州醫科大學附屬第一醫院中醫科，廣東 廣州 512000）

慢性阻塞性肺疾病 (COPD)是常見的呼吸道疾病，發病率及死亡率均較高。世界衛生組織預言到2020年，COPD在“全球疾病死亡率”的排名將上升到第3位[1]。目前，現代醫學對COPD的治療一直未有實質性突破。常用的藥物治療只能緩解癥狀和/或并發癥，但不能扭轉COPD肺功能的長期下降[2]。尤其是在COPD的穩定期，長期應用支氣管擴張劑或糖皮質激素治療，副反應大，費用昂貴，且不能避免患者的反復感染，導致疾病纏綿難愈，病情進行性加重，患者的生活質量嚴重下降，最終危及生命[3]。COPD的病理生理變化趨于影響全身各系統[4]，不斷惡性循環，使其防治措施更加復雜化，因此單一治療方法已不能取得較好的療效，近年的研究成果也從不同角度顯示出，中醫藥對COPD發生發展過程中各病理環節都有一定的作用。

本研究選用臨床療效確切的天龍組方，在以往的研究基礎上，通過對腎虛證COPD模型大鼠肺功能及炎癥因子IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α的蛋白表達等方面的研究，探討天龍組方對腎虛證COPD大鼠模型的干預作用及可能的分子機制，為中醫防治COPD提供新的思路和方法，具有一定的理論意義和較廣闊的臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SPF級Wistar大鼠，體質量 (260±20)g，購自廣東省實驗動物中心，生成許可證號：SCXK(京)2012-0001，飼養在廣州醫科大學附屬第一醫院，室溫（22±2）℃，相對濕度30%～40%，常規飼料喂養，自由進食飲水，適應性飼養1周后用于實驗。

1.2 試劑和儀器 水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20110401）；ECL Plus發光試劑盒、SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α單克隆抗體 （abcam公司）；goat anti-rabbit（二抗，bioworld公司）；酶標儀（SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司）；電泳系統（Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司）；凝膠成像儀（ChemiDoc XRS+System，Bio-RAD公司）。

1.3 腎虛證COPD大鼠模型的復制 用熏吸香煙加氣管內注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，在皮下注射醋酸氫化可的松建立復合腎虛證模型。第1 d、14 d氣道內注入脂多糖 (LPS)0.2 mL (1 μg/μL，美國Sigma公司)，第2～13 d及第15～28 d放入自制的玻璃箱內煙薰(紅雙喜烤煙型香煙，每天2次，每次1 h)；第22天起背部皮下注射濃度為25 mg/mL的醋酸氫化可的松，每天0.3 mL/只，連續8 d。

1.4 藥物、動物分組及給藥方法 天龍組方主要組成：青天葵10 g，款冬花15 g，法半夏10 g，制附片30 g，五味子5 g。購于廣州醫科大學附屬第一醫院，10倍量水煎煮2次，濾液濃縮后冷凍干燥成粉，臨用前蒸餾水適量復溶。依據70 kg成人用量折算成大鼠等效劑量。

雄性SPF級Wistar大鼠，體重 (260±20)g，隨機分為4組，正常組、模型組、天龍組方組、布地奈德組，每組10只。

正常組：第1 d、14 d氣道內注入生理鹽水0.2 mL，第2～13 d及第15～28 d將大鼠放入自制的0.22 m3玻璃箱內 (每天2 h)，不用煙薰。在氣道內注入生理鹽水前3 d及第2～13 d，第15～28 d在放入箱前用生理鹽水灌胃 (10 mL/kg/d)；模型組：按腎虛證COPD大鼠模型的復制方法造模，造模前3 d， 第2～13 d及第15～28 d用生理鹽水灌胃 (10 mL/kg/d)；天龍組方組：按模型組方法造模，造模前3 d，第2～13 d及第15～28 d用天龍組方煎劑灌胃（10 mL/kg/d，大鼠給藥劑量按體表面積公式換算）；布地奈德組：按模型組方法造模，每只大鼠從第21 d起每天薰煙前用霧化器在一密閉容積內霧化吸入布地奈德混懸液，濃度為0.5 g/L的液體8 mL，50 min，余處理同模型組。

1.5 研究方法

1.5.1 肺組織形態學測量 取右肺下葉標本，用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋、蘇木精染色、切片。光鏡下觀察大鼠肺組織，確定COPD的病變及其治療效果。

1.5.2 肺功能測定 造模24 h后，大鼠分別用10%水合氯醛麻醉，并固定于手術板，縱向切開頸部皮膚約2 cm，分離皮下組織，暴露氣管，于環狀軟骨處作2個倒T型切口，插管后連接肺功能儀，將大鼠固定于體描箱內。觀測大鼠通氣功能主要指標包括檢測大鼠FVC（用力肺活量），FEV1（第一秒用力呼氣容積），FEV1/FVC，FEF25%（用力呼氣流量25%），MMF（最大呼氣中期流速），PEF（最大呼氣流速）等肺功能指標。

1.5.3 ELISA法檢測 支氣管肺泡灌洗液BALF中IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α炎癥因子的水平采用的雙抗體免疫組化法測定樣品中IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α的水平。在預先包被IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α單克隆抗體的酶棟孔中加入樣品，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗涂，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中IL-6，IL-8，NF-κB， TNF-α的濃度呈線性。具體試驗操作參考試劑盒標準操作流程。

2 結果

2.1 肺組織病理結果 肺組織病理切片經H&E染色，在光學顯微鏡下可見：正常組大鼠氣道上皮結構完整，纖毛排列整齊，肺泡結構正常。模型組大鼠細支氣管狹窄變形，呼吸性支氣管管腔狹小甚至閉塞，管壁明顯增厚，有小葉中型肺氣腫和全小葉型肺氣腫形成，肺間質增寬，間質中可見大量的炎性細胞浸潤，部分肺泡壁變薄，呈絲狀連接，多個肺泡融合形成肺氣腫。天龍組方組和布地奈德組大鼠的肺組織部分由肺間質增寬，間質偶有炎性細胞浸潤，病理損害輕重程度與模型組不同，經治療后肺泡擴張和炎性浸潤得到明顯改善。

圖1 不同組別大鼠肺組織H&E染色病理切片

2.2 肺功能指標 如表1所示，與正常組相比，模型組FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、MMF水平顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，各用藥組FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、MMF水平均顯著提高 (P<0.05)。說明各用藥組大鼠的肺功能經不同藥物治療后均得到不同程度的改善。

表1 不同組別間肺功能指標數據表 （±s）

表1 不同組別間肺功能指標數據表 （±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 FVC FEV1 FEV1/FVC正常組模型組天龍組方組布地奈德組21.40±1.32 12.13±1.82**17.64±1.96##18.01±1.34##36.87±2.58 28.51±1.99*34.60±2.75#33.91±3.18#1.72±0.35 2.35±0.51**1.96±0.27##1.88±0.64##FEF25% MMF 48.17±1.98 36.89±1.54**44.77±1.91#45.67±2.17#45.73±2.36 36.28±1.88*46.19±3.51##42.14±2.61#

2.3 BALF液中IL-6， IL-8， NF-κB， TNF-α的含量如圖2～5所示，模型組大鼠BALF液中炎癥因子IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α比正常組顯著升高，提示造模成功。給予天龍組方干預COPD大鼠后，炎癥因子IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α顯著下降，說明天龍組方可以對抗COPD過程中炎癥因子的釋放，緩解慢性炎癥，從而起到治療的藥效。同時，天龍組方藥效與陽性對照藥基本一致或稍優，提示其在COPD臨床治療中具有一定的應用前景。

圖2 不同組別間BALF液中IL-6含量比較圖

圖3 不同組別間BALF液中IL-8含量比較圖

圖4 不同組別間BALF液中NF-κB含量比較圖

圖5 不同組別間BALF液中TNF-α含量比較圖

3 討論

COPD按其臨床表現一般歸屬為中醫的“喘證”“肺脹”“水腫”等范疇，多為久咳、久哮、久喘遷延不愈發展而成。中醫藥對COPD的防治已取得一定的成效，研究內容主要集中在COPD的病因病機，臨床治療及中醫藥作用機理等方面。對COPD的病因病機研究，主要集中在痰、瘀、虛三個方面，中醫認為內在的臟腑功能失調導致的肺脾腎虛、痰濁、血瘀為本病的內在病機病理變化，多傾向本虛標實，本虛以肺脾腎虛為主，標實為痰瘀為主，故臨床治療時應“標本兼顧”，虛實同治。

課題組在長期的臨床研究中發現：COPD患者因長期咳、痰、喘，耗傷肺氣，損及脾腎，致痰濁內蘊，瘀滯內生，痰瘀郁久亦易化熱，其標在肺，其本在脾腎。因而在急性期后仍具痰熱余邪依戀不清、壅塞肺氣的病機。故其治療應在清肺化痰的同時，注意溫腎化痰與活血逐瘀。溫腎則氣納喘平，活血則瘀去痰易化。本項目組選用的天龍組方是由國家第二批名老中醫、中醫呼吸疾病專家邱志楠教授根據多年臨床經驗，結合COPD的病機特點，創制的以“溫腎活血化痰”為主要治法的中藥復方。方中主要藥物熟附子可振奮腎中之元陽，復其氣化衛外之能；青天葵為兼治痰瘀熱之品，消痰解毒化瘀又不傷陰血耗氣，款冬花溫肺平喘；法半夏溫化痰飲，燥濕降逆，又能健運脾氣；五味子斂肺而滋腎。全方溫腎納氣并舉，攻補兼施并用。經大量的臨床檢驗，療效確切，可顯著改善COPD患者緩解期的咳、痰、喘等癥狀，提高生活質量，較好地保護肺功能，減緩肺功能下降，提高FEV1/FVC%、MMEF等指標。