柱前衍生結合高效液相色譜-熒光法測定水中草銨膦

王姍姍，俞瑞鮮，王菲迪，呂 露，吳聲敢，范 艷，趙學平

(浙江省植物有害生物防控重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地 農業部農藥殘留檢測重點實驗室浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

草銨膦是一種膦酸類、廣譜、非選擇性、觸殺性和非殘留性除草劑。與草甘膦相比，草銨膦更能有效去除多年生惡性雜草[1-3]。盡管草銨膦屬于非持久性農藥，但其大量使用仍造成了嚴重的環境污染。大量研究表明，低劑量草銨膦會影響初生動物腦部發育，動物食用過量草銨膦會導致發抖、抽搐、呼吸困難等中毒癥狀。同時，草銨膦的不合理使用還會對水體造成污染，尤其對飲用水的污染將會對人體健康產生重大威脅[4-7]。因此，很有必要建立一種簡便、快速的草銨膦檢測方法。

草銨膦在結構中含有膦酸基、氨基、羥基，是極強的兩性化合物。使用氣相色譜和氣相色譜-質譜聯用技術進行草銨膦檢測時，需要將其轉化成可氣化的物質，該操作會引入過多的其他試劑，且操作過程繁瑣，檢測效率和靈敏度都相對較低[8-11]。草銨膦紫外吸收弱，且很難在常規的C18柱子長保留，所以使用液相色譜-紫外測定時靈敏度較低[12-13]。使用液相色譜-質譜直接測定草銨膦時，儀器響應較低，且需要離子交換柱等特殊柱子進行分離。所以，目前文獻報道中常采用氯甲酸-9-芴基甲酯對草銨膦進行柱前衍生，再結合液相色譜質譜法和液相色譜-熒光法進行草銨膦檢測[14-19]。雖然固相萃取小柱可以去除反應體系中的硼酸鈉鹽和部分雜質，但仍不能完全去除衍生化試劑水解產物和一些影響草銨膦定量的干擾雜質。另外，衍生化試劑水解產物濃度高，進入質譜會造成離子源的污染，影響質譜的穩定性，干擾草銨膦的準確定量。本文采用液相色譜-熒光法在Waters Atlantis?T3色譜柱上對草銨膦衍生化產物進行分離，在不使用固相萃取小柱的前提條件下，排除了雜質對草銨膦定量的干擾，為水中草銨膦的檢測提供了一個簡便、快速、準確的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(色譜純，Merck公司)，乙酸銨(色譜純，美國Tedia公司)，飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，丙酮(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，二氯甲烷(分析純，杭州雙林化工試劑廠)，四硼酸鈉(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，氯甲酸-9-芴基甲酯(分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司)，草銨膦(純度97.5%，購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH)。

1.2 儀器與設備

Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，配有自動進樣器、熒光檢測器，紫外檢測器)，Waters Atlantis?T3液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，美國Waters公司)，GEMINI C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，美國Phenomenex公司)，CNWBON LC-C18固相萃取柱(500 mg/6 mL，上海安譜公司)，OASIS HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美國waters公司)，AB104-S電子天平(感量0.000 1 g，梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司)，OHAUS SPS202F 型電子天平(感量0.01 g，奧豪斯儀器常州有限公司)，MX-S可調式混勻儀(北京大龍興創實驗儀器有限公司)，HH-4 恒溫水浴鍋(江蘇金壇市江南儀器廠)，10 mL棕色樣品瓶，移液槍，容量瓶等。

1.3 標準溶液、緩沖鹽溶液和衍生化試劑的配制

草銨膦標準儲備液和標準工作液。電子天平稱取草銨膦標準品0.020 5 g(純度為97.5%)，用飲用純凈水定容至10.00 mL，得到濃度為2.00×103mg·L-1標準儲備液。用飲用純凈水逐級稀釋草銨膦標準儲備液，得到濃度為0.200、0.100、0.050 0、0.020 0、0.010 0、0.005 00和0.002 00 mg·L-1的草銨膦標準工作液。

四硼酸鈉緩沖溶液。稱取3.80 g四硼酸鈉，用飲用純凈水定容至100.0 mL，得到濃度為0.100 mol·L-1的四硼酸鈉水溶液。

氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液：稱取0.10 g氯甲酸-9-芴基甲酯，用分析純丙酮定容至100.0 mL，得到濃度為1.0 mg·mL-1的氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液。

1.4 色譜條件

Waters Atlantis?T3液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫40 ℃；進樣量20.0 μL，流速。0.8 mL·min-1，流動相A為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液(稱取0.385 4 g乙酸銨，用飲用純凈水定容至1 L，0.22 μm濾膜過濾后使用)，流動相B為色譜純乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，90%A；1～12 min，90%A～50%A；12～13 min，50%A；13～14 min，50%A～10%A；14～17 min，10%A；17～17.1 min，10%A～90%A；17.1～25 min，90%A。

1.5 樣品衍生

移取1 mL水樣于10 mL棕色玻璃樣品瓶中，分別依次加入0.5 mL 0.1 mol·L-1的四硼酸鈉水溶液和1 mL 1 mg·mL-1的氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液，蓋緊瓶蓋，渦旋約30 s，在40 ℃的水浴下反應30 min。反應完成后，將全部液體轉移至10 mL的刻度管中，加入4 mL的分析純二氯甲烷，振蕩1 min，室溫下靜置約10 min后取上層水樣過0.22 μm濾膜，進行高效液相色譜檢測。

2 結果與分析

2.1 衍生化條件的優化

通過對比不同的衍生化試劑體積(0.5、1.0和2.0 mL)、硼酸鈉緩沖鹽體積(0.5、1.0和2.0 mL)以及衍生化時間(0.5、1.0、1.5和2.0 h)來確定最優的衍生化條件。根據試驗結果，最終選擇衍生化試劑體積1 mL，硼酸鈉體積0.5 mL和衍生化0.5 h作為草銨膦衍生化反應的最終條件。

2.2 固相萃取條件的選擇

根據文獻報道[15，18]，比較CNWBON LC-C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)和OASIS HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL)的凈化效果表明，以上2種固相萃取小柱都無法去除衍生化試劑的水解產物和干擾草銨膦衍生化產物定量的雜質，故本實驗中不再使用固相萃取小柱，而是選擇合適的液相柱子排除雜質對草銨膦定量的干擾。

2.3 流動相和色譜柱的選擇

根據文獻報道[14]，選擇乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨水溶液作為衍生化產物的色譜分離的流動相，通過調整兩者的比例確定最優的液相條件。對Waters Atlantis?T3色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和Phenomenex GEMINI C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)的分離效果考察結果表明，以上2種柱子都可將衍生化試劑水解產物和草銨膦衍生化產物很好的分離，但使用Phenomenex GEMINI C18液相色譜柱時，無法將草銨膦衍生化產物與其極性相似的干擾雜質分離，導致無法準確定量草銨膦(圖1)。使用Waters Atlantis?T3色譜柱，采用1.4色譜條件進行草銨膦衍生物分離時，不僅可獲得很好的峰形，而且可實現草銨膦衍生化產物與其干擾雜質的基線分離，從而保證草銨膦的準確定量(圖2)。

圖1 草銨膦衍生化產物(0.00 500 mg·L-1)的Phenomenex GEMINI C18柱色譜圖

圖2 草銨膦衍生化產物(0.00 500 mg·L-1)的Waters Atlantis? T3柱色譜圖

2.4 線性關系、回收率和精密度

如圖3所示，將0.002、0.005、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100和0.200 mg·L-1的草銨膦標準工作液衍生化產物進樣分析，以草銨膦濃度、草銨膦衍生化產物峰面積繪制標準曲線，得到回歸方程為y=2 701.5x+1.305 2(R2=0.999 9)。

圖3 草銨膦標準曲線

在自來水中添加3檔濃度的草銨膦標準溶液，其濃度分別為0.003 00、0.300和30.0 mg·kg-1，每檔濃度設5個平行樣品。平均回收率和相對標準偏差見表1，該方法的檢出限(S/N=3)為0.000 370 mg·kg-1，定量限(S/N=10)為0.001 23 mg·kg-1。

表1 不同添加水平下自來水中草銨膦的 回收率和相對標準偏差

3 小結

本文采用柱前衍生-高效液相色譜-熒光法建立了水中草銨膦的檢測方法，該方法不需要固相萃取小柱即可排除雜質對草銨膦定量的干擾，且由于排除了雜質的干擾，使得該方法的檢出限為0.000 370 mg·kg-1，定量限為0.001 23 mg·kg-1，可與液相色譜-質譜相媲美，同時還可避免高濃度的衍生化試劑水解產物對離子源的污染，為水中草銨膦的檢測提供了一個簡便、快速、準確的方法。