雌激素與孕激素聯合應用對老齡小鼠乳腺的影響

宋 暮，高 慧，董巧香*

(溫州醫科大學 a檢驗醫學院 生命科學學院，b公共衛生與管理學院，浙江 溫州 325035)

雌激素及孕激素是雌性動物體內重要的內分泌激素，圍絕經期及絕經期女性因體內缺乏雌激素，將導致一系列生理及心理癥狀，如抑郁潮熱、泌尿生殖系統萎縮、骨質疏松等。故而，臨床常用補充外源性雌激素來改善上述癥狀。目前研究對于激素替代療法增加乳腺癌、子宮內膜癌及卵巢癌等的風險處于爭議階段[1]。相關乳腺癌的統計學資料表示，乳腺癌的發生發展與年齡密切相關，乳腺癌的發病人群主要為50歲以上的老齡女性，衰老能在某些程度上促進乳腺癌的發生和發展[2]。

激素替代療法又名HRT，狹義的HRT即為雌激素替代療法，目前常用的雌激素替代療法包括單用雌激素、雌激素及孕激素序貫應用、雌激素及孕激素連續應用[3]等。因單用雌激素增加了子宮內膜癌的風險[4]，故此療法僅用于無子宮的老年女性。雌、孕激素序貫療法模擬正常生理周期，具有激素撤退性子宮出血等特點。而雌、孕激素連續應用因避免了子宮周期性出血而被廣泛應用，臨床調研表明，該法較其他療法增加了乳腺癌的發病風險。研究表明，長期聯合應用雌、孕激素增大了乳腺癌的發病風險，且服藥時間越長，風險越高[5]。與此同時，也有研究表明，激素替代療法對乳腺癌的發病風險被高估[5]。目前已有許多體內及體外模型研究激素替代療法對雌性動物乳腺上皮組織及乳腺癌細胞系的影響。雌激素及孕激素能夠促進人乳腺組織增殖，其表達相關標志物Ki67及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)增加[6]。切除成年小鼠雙側卵巢構建絕經期動物模型，經雌激素療法后，其乳腺上皮增殖能力及導管末端芽比例上升[7]。同時，激素替代療法增加絕經期女性的乳腺上皮密度。應用孕激素增加了小鼠乳腺基底上皮群的比率且激活了RANKL及Wnt等相關通路。

衰老為生物體的增齡性功能下降，有基因組失穩，端粒耗損，干細胞衰竭等特征[8]。研究發現，衰老細胞積累及其釋放某些細胞因子和各種蛋白酶，能夠為敏感細胞群提供癌變環境。細胞損傷的增齡性累積是衰老的總原因[9]，同時，細胞損傷又為特定細胞發生癌變提供有利條件，并最終導致腫瘤的發生。

目前針對激素替代療法與乳腺癌的研究主要著力于大范圍的臨床調研統計分析及應用去勢的成年雌性小鼠模擬體內低激素水平研究激素替代療法與乳腺組織學及相關通路，而摘除卵巢構建的絕經期小鼠模型不能完全模擬絕經期衰老及正常的內分泌環境，且切除卵巢會產生一定的創傷應激反應。本研究利用無動情周期的老齡小鼠，進行激素替代療法，研究雌激素與孕激素聯合應用對小鼠乳腺的影響，以期為激素替代療法的臨床用藥及相關乳腺癌風險提供相應的依據及指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

C57-WT母本小鼠購自南京醫科大學，本實驗所用小鼠為母本小鼠在SPF級動物房自然繁殖的子代小鼠。

1.1.2 儀器與試劑

流式細胞儀，美國BD；石蠟切片機，德國Leica；光學顯微鏡及解剖顯微鏡，日本尼康。

雌二醇、孕酮粉劑、WM染液、蘇木精及伊紅染液，美國Sigma；免疫組化抗體ERα及Ki67，美國Stemcell。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

取16月齡小鼠，隨機分為3組，每組4只。對照組以芝麻油灌胃2個月，短期處理組以雌二醇聯合孕酮灌胃14 d后改芝麻油灌胃至2個月，長期處理組以雌二醇聯合孕酮灌胃2個月。根據臨床用藥指南[10]，雌孕激素聯合應用基本療法為雌二醇0.5～1 mg·d-1結合孕酮100 mg·d-1，根據人與動物藥物換算公式及結合相關文獻[11]，本實驗所用雌二醇的劑量為150 μg·kg-1，孕酮劑量為15 mg·kg-1。雌二醇和孕酮粉劑按灌胃濃度置于芝麻油中并以超聲助溶。

1.2.2 乳腺WM染色

取小鼠一側腹股溝處乳腺，置于WM固定液中固定10 h，以70%、50%酒精及超純水梯度處理后，置于WM染色液中過夜染色，染色后再以70%、95%及100%酒精梯度脫水，最后置于水楊酸甲酯中進行透化處理。導管分支點為隨機選擇一段二級導管，測量出長度(a)及計數出其上分支點的數目(n)，n/a的比值即為單位長度二級導管上的分支點數目。

1.2.3 乳腺HE染色

含有樣本的切片經烘片，二甲苯、100%酒精、90%酒精、80%酒精、超純水等處理后以蘇木精染液染色40 s，分化后以伊紅染色2 min，再經脫水處理后以中性樹脂封片。HE染色后對乳腺導管進行分類統計，并對良性增生的導管比例進行統計分析。

1.2.4 乳腺IHC染色

含有樣本的切片經烘片，二甲苯、100%酒精、90%酒精、80%酒精、超純水一系列復水的過程后以檸檬酸鈉或EDTA進行抗原修復，再經氧化氫處理，然后以0.3% PBST進行破膜，洗滌后以10%山羊血清進行封閉30 min。封閉后的切片去除血清，敷上合適濃度的一抗，4 ℃過夜后取出，合適濃度的含HRP的二抗孵育1 h后，去除二抗，洗滌后避光加入DAB染液避光孵育5 min，切片泛黃即可，再經超純水、濃度梯度的酒精、二甲苯等進行脫水，最后以中性樹脂進行封片。IHC染色結果為導管內陽性細胞與總導管細胞數目之比，記為染色陽性率。陽性細胞為染色為棕色的細胞。

1.2.5 統計分析

采用Graphpad Prism 6軟件對數據進行單因素方差分析及t檢驗，測定結果以平均值±標準差表示，P<0.05時判定為差異顯著。各組間差異顯著性用*表示(P<0.05為*，P<0.01為**，P<0.001為***)。

2 結果與分析

2.1 對小鼠乳腺導管分支的影響

如圖1所示，雌、孕激素長期聯合處理后，小鼠乳腺導管密度增加，且乳腺導管三級分支增加，主要表現為單位長度乳腺二級導管上分支點的顯著增多。雌孕激素短期處理后，其導管密度及單位長度乳腺二級導管上分支點無顯著性改變。

2.2 對小鼠乳腺導管增生的影響

如圖2所示，正常乳腺導管為外層基底上皮、內層管腔上皮細胞的雙層結構。良性增生導管表現為導管內細胞增生呈多層結構，核染色質清晰，仍可見管腔。非典型增生表現為導管腔內大量不規則上皮細胞增生，細胞增生互相聯結，彌漫成片，充塞管腔，形成實性，且核仁增大，形態不一，排列紊亂。結果表明，雌、孕激素長期聯合處理后，乳腺導管良性增生比例增加，并出現非典型增生。雌孕激素聯合短期處理后，乳腺導管組織學無顯著改變。

2.3 對小鼠乳腺上皮細胞的影響

如圖3所示，雌、孕激素長期聯合應用后，小鼠乳腺上皮細胞中ERα陽性細胞核的比例上升，且增殖相關標志物Ki67的表達也上升。雌孕激素短期處理后，ERα及Ki67的表達無顯著變化。

圖1 WM染色結果

圖2 HE染色結果

圖3 IHC染色結果

3 討論

雌激素、孕激素是乳腺導管發育及產生功能性作用的重要內分泌激素，目前對這兩者的功能性作用及相互作用機制尚未闡明。雌孕激素替代療法用于改善圍絕經期及絕經期癥狀而在臨床上廣泛應用，對于其增加乳腺癌風險的相關性褒貶不一。目前部分研究表明，雌孕激素長期聯合應用是乳腺癌發病風險增加的重要因素之一，但也有研究認為高估了激素替代療法對乳腺癌發病風險增加的可能性。同時，一系列組織學檢查及動物體內實驗表明，雌、孕激素聯合應用使人及小鼠乳腺組織呈高度增殖狀態，而細胞過度分裂及增殖也可能在一定程度上增加如DNA損傷及基因編碼異常的可能性[12-13]。

本實驗對實驗用老齡小鼠進行陰道分泌物涂片染色，其陰道圖片所見細胞稀疏或無正常細胞，不符合正常陰道圖片染色結果，且實驗處理后解剖發現，其卵巢均表現為萎縮狀或者形成囊腫，不具備正常卵巢分泌相關激素功能，因而，本實驗用小鼠符合圍絕經期或絕經期低雌激素及衰老的內環境。研究結果表明，經雌、孕激素長期處理后，乳腺導管的密度及分支點增加，表明乳腺處于動態性的增殖狀態，且乳腺導管良性增生的比例增加，并出現非典型增生結構，而乳腺導管的非典型性增生是乳腺癌發病風險增加的重要表征之一[14-15]，表明雌二醇聯合孕酮長期應用可增大乳腺癌的發病風險。Ki67作為細胞增殖的標志物被廣泛應用，它作為細胞增殖相關的核抗原，在正常乳腺細胞和未病變的乳腺細胞中也有所表達，但是陽性率低于3%[16]。研究結果表明，對照組的Ki67陽性率低于3%，表明對照組小鼠乳腺組織具有正常的增殖狀態。ERα為雌激素受體成員之一，是雌激素發揮作用的重要樞紐。已有研究表明，雌激素可作用于ERα，通過Stat5a及Gata 3等旁分泌機制作用于臨近細胞，促進周邊細胞群大量增殖及干細胞分化等[17]。免疫組化結果表明，雌、孕激素聯合處理后ERα的比例上升，Ki67比例上升，結合WM染色和HE染色結果，我們推測這可能是在雌激素與孕激素的聯合作用下，激活了ERα旁分泌系統，促進乳腺導管分支及類腺泡狀導管芽形成，使乳腺組織呈增殖狀態。

本研究采用了具備天然的無動情周期的老齡小鼠，對雌激素與孕激素聯合應用對小鼠乳腺的影響做了一系列研究。本研究所用的實驗對象很大程度上模擬了圍絕經期及絕經期的低雌激素及衰老內環境的特征，填補了目前研究的不足。雌激素與孕激素聯合應用短期對乳腺導管各項特征無顯著影響，不增加乳腺癌的發病風險，而長期應用在一定程度上促進了乳腺的組織學改變及上皮細胞比例構成改變，同時促進乳腺組織的增殖。