納米二氧化鈦暴露對青春期小鼠乳腺的影響

季坤源，高 慧，董巧香*

(溫州醫(yī)科大學(xué)a檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，b公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

納米顆粒，又稱超細粒子，其粒徑介于1～100 nm之間，具有宏觀材料不具有的許多優(yōu)異特性，如表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和量子隧穿效應(yīng)等[1-2]。隨著科技的發(fā)展，納米材料逐漸走入人們生活。納米二氧化鈦是應(yīng)用最廣泛的納米材料之一，廣泛應(yīng)用于化妝品、紡織品、遮光劑、消毒劑以及運動用品等。研究發(fā)現(xiàn)，在暴露納米二氧化鈦的小鼠肝臟、肺、腦可以檢測到納米顆粒的存在。

隨著納米材料應(yīng)用的普及，近年來它的安全性也受到普遍關(guān)注[3]。納米二氧化鈦可通過呼吸道達到肺泡末端，誘發(fā)肺的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，長期會造成肺的纖維化[4]，同時納米二氧化鈦可進入血液[5-6]，影響大腦功能[7]，造成肝臟損傷[8]等。研究發(fā)現(xiàn)，與柴油機尾氣中的顆粒物和炭黑等納米粒子相比，納米二氧化鈦對睪丸間質(zhì)細胞有更強的毒性。納米二氧化鈦可透過雄性小鼠血睪屏障，導(dǎo)致雄性小鼠的體重增長率、精子質(zhì)量與活性遠低于對照組[9]。青春期雄性小鼠暴露于不同濃度的納米二氧化鈦，成年后采集血清與睪丸進行相關(guān)指標檢測發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦的濃度越高，小鼠血清睪酮的含量越低，睪丸組織學(xué)改變程度越大[10]。Gao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦可顯著降低雌性小鼠血清雌激素的含量，小鼠卵巢功能下降。納米二氧化鈦可能通過影響性激素水平或性激素信號通路，從而影響睪丸和卵巢[10-11]。

本研究采用C57BL/6-GFP品系的雌性小鼠為模型，研究納米二氧化鈦暴露對青春期小鼠乳腺發(fā)育影響。通過對乳腺的異常變化分析納米二氧化鈦在乳腺病變發(fā)展過程中的作用，為探究納米二氧化鈦作為環(huán)境污染物的作用機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6-GFP小鼠引種于南京醫(yī)科大學(xué)，現(xiàn)本實驗室可自行繁殖。小鼠飼養(yǎng)過程嚴格按照溫州醫(yī)科大學(xué)動物管理中心實驗動物規(guī)則飼養(yǎng)。籠具、飲用水及飼料中均不含納米二氧化鈦，可以排除外界環(huán)境因素對實驗的干擾。

1.1.2 儀器與試劑

動物麻醉系統(tǒng)，美國Microflex公司；石蠟切片機，德國Leica公司；光學(xué)顯微鏡及解剖顯微鏡，日本尼康公司。

納米二氧化鈦粉末(5 nm)，碧云天公司；蘇木精、伊紅，美國Sigma公司；Ki67抗體，美國Thermo公司；ERα抗體，美國Santa公司；酒精、福爾馬林、二甲苯溶液和封片劑，美國Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

將3周齡雌性小鼠隨機分為3組，每組5只，分別為對照組(超純水)、納米二氧化鈦低劑量處理組(50 mg·kg-1)和納米二氧化鈦高劑量處理組(250 mg·kg-1)，在相同的時間點每天灌胃1次，持續(xù)28 d。第29 d小鼠麻醉后頸椎脫臼處死，并記錄體重。取出小鼠的肝臟和子宮，稱重并拍照。取出小鼠乳腺，腹股溝處乳腺用于組織整體染色(WM染色)，胸腺處乳腺固定于福爾馬林溶液中，采用常規(guī)石蠟包埋。

1.2.2 乳腺組織學(xué)定量分析

乳腺導(dǎo)管進行病理學(xué)切片和HE染色，觀察到導(dǎo)管的4種形態(tài)，即正常的雙層細胞結(jié)構(gòu)為主的乳腺導(dǎo)管、多個細胞層增生性病變的導(dǎo)管、非典型腺管增生的導(dǎo)管和發(fā)生原位癌的導(dǎo)管。顯微鏡下對以上乳腺導(dǎo)管形態(tài)分別進行觀察計數(shù)，計算增生性導(dǎo)管結(jié)構(gòu)所占比例。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色

將組織切片脫蠟，浸到梯度酒精中進行水合，然后放到提前預(yù)熱的抗原修復(fù)液中，15 min后放入封閉內(nèi)源性過氧化物酶中，取出進行細胞透膜，然后敷血清和一抗，過夜后去掉一抗，敷二抗并染DAB，觀察到棕色后進行蘇木精復(fù)染， 然后酒精脫水，最后封片保存。顯微鏡下觀察Ki67和ERα的表達情況，當1個導(dǎo)管染上棕色的細胞數(shù)占總細胞數(shù)比例大于或等于20%時，認為該導(dǎo)管表達此抗原。計算Ki67和ERα表達導(dǎo)管所占比例。

1.2.4 統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及t檢驗，測定結(jié)果以平均值±標準差表示，P<0.05時判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對青春期小鼠肝臟、子宮的影響

肝臟作為外來藥物代謝的重要器官，它的變化反映藥物毒性的大小。圖1所示，處理組肝臟指數(shù)沒有顯著變化，表明該劑量納米二氧化鈦對小鼠未產(chǎn)生顯著的毒性效應(yīng)。子宮作為哺乳動物重要的生殖器官，對乳腺的發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。實驗結(jié)果顯示，處理組小鼠子宮長度和寬度均未發(fā)生明顯的變化，說明納米二氧化鈦對小鼠子宮形態(tài)無顯著影響。

圖1 小鼠的肝臟指數(shù)與子宮的長寬度

2.2 對青春期小鼠乳腺導(dǎo)管形態(tài)的影響

小鼠乳腺導(dǎo)管密度和末端芽數(shù)量見圖2。如圖所示，低劑量處理組小鼠乳腺末端芽數(shù)量較對照組顯著增加，高劑量處理組乳腺導(dǎo)管密度較對照組降低。

圖2 小鼠乳腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)

2.3 對青春期小鼠乳腺病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

正常的乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)由2層細胞構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)有利于小鼠懷孕時導(dǎo)管分化為腺泡，便于乳汁的分泌與輸送。當乳腺發(fā)生病變時，出現(xiàn)多層細胞的增生，懷孕時導(dǎo)管分化為腺泡和腺泡分泌乳汁的能力降低。如圖3所示，低劑量納米二氧化鈦處理以后，增生性導(dǎo)管的比例有增加的趨勢，高劑量暴露對增生性導(dǎo)管的比例沒有明顯的影響。

圖3 小鼠乳腺組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 對青春期小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα表達的影響

對乳腺導(dǎo)管分別進行Ki67和ERα染色，以研究納米二氧化鈦對乳腺的作用機制。Ki67是增殖蛋白，處在有絲分裂期的細胞高表達Ki67，主要定位在細胞核中。ERα為雌激素受體，主要表達在乳腺的管腔干細胞中，在細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核中都有表達。雌激素與細胞核上的雌激素受體結(jié)合可引發(fā)基因調(diào)控機制，進一步控制下游基因的轉(zhuǎn)錄。如圖4所示，低劑量納米二氧化鈦暴露顯著增加青春期小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα的表達。

圖4 小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα的表達

3 討論

本研究對C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在青春期時進行納米二氧化鈦暴露，研究發(fā)現(xiàn)，處理組小鼠肝臟指數(shù)、子宮長度和寬度均較對照組無顯著差異。低劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺末端芽的數(shù)量顯著增加，Ki67和ERα的表達量顯著上升。高劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導(dǎo)管密度降低。

已有納米二氧化鈦的安全性研究結(jié)果不一致，納米二氧化鈦的應(yīng)用是否安全還沒有明確的結(jié)論。納米二氧化鈦可通過呼吸道、消化道、皮膚以及注射等多種途徑進入機體，損傷體內(nèi)組織器官[12]。納米二氧化鈦具有小粒徑效應(yīng)，可通過簡單的自由擴散和滲透方式進入體內(nèi)，透過細胞膜進入細胞乃至核內(nèi)，另外納米二氧化鈦具有高化學(xué)活性，這一特性促使細胞損傷，從而影響細胞的增殖、分化及凋亡[13-14]。

青春期乳腺導(dǎo)管密度、分支結(jié)構(gòu)、末端芽的數(shù)量和病理學(xué)結(jié)構(gòu)的異常變化是乳腺病變發(fā)展過程中的重要參考因素[15-16]。本研究結(jié)果顯示，高劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導(dǎo)管變得稀疏，可能是高劑量的納米二氧化鈦抑制了小鼠乳腺的發(fā)育，低劑量沒有這一作用。青春期小鼠末端芽有促進導(dǎo)管分支、延長的作用[17]，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)低劑量納米二氧化鈦處理后，末端芽顯著增加，說明低劑量納米二氧化鈦促進了乳腺的異常發(fā)育，但高劑量納米二氧化鈦的暴露對小鼠乳腺末端芽沒有明顯的影響。為了探究納米二氧化鈦的作用機制，對乳腺導(dǎo)管進行了Ki67和ERα染色。青春期小鼠低劑量納米二氧化鈦暴露能夠使乳腺Ki67表達量顯著增加，Ki67是反映細胞增殖能力的蛋白標志物，可能是納米二氧化鈦損傷乳腺細胞，機體為了平衡乳腺代謝，使處于靜止期的乳腺干細胞進行快速增殖。在乳腺癌患者中，雌激素受體表達量與激素治療是否敏感有關(guān)[18-19]，經(jīng)低劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導(dǎo)管高表達ERα蛋白。ERα是雌激素信號通路的下游蛋白，推測低劑量納米二氧化鈦可能通過干擾性激素信號通路影響乳腺的發(fā)育。高劑量納米二氧化鈦處理對小鼠乳腺導(dǎo)管Ki67和ERα的表達沒有顯著的影響，可能因為暴露劑量過高導(dǎo)致機體反應(yīng)遲鈍。本研究結(jié)果為進一步探究納米二氧化鈦對小鼠乳腺的毒性作用和潛在機制提供新的依據(jù)和啟示。