慢性鋁中毒小鼠學習記憶與大腦皮層ACh、β-EP、SOD及MDA關系的研究

莫頌軼，張麗鳳，黃彥峰，余雙全，廖素嬋，黃永毅，梁祚仁，黎 昀，蔣敏麗，黃俊杰

(右江民族醫學院應用生理研究室，廣西 百色 533000)

由于鋁在各領域的廣泛應用，人類在日常生活中接觸鋁制品的日益增多，鋁可被攝取、吸收并在全身組織器官中分布[1-2]。鋁是一種慢性神經毒性物質，腦是鋁的蓄積部位和主要靶器官，鋁可通過血腦屏障進入腦組織產生神經行為毒性作用，神經細胞對于鋁的毒性十分敏感，長期鋁暴露可導致人的認知能力和智力下降[3-4]。鋁暴露所導致的神經系統損害已成為全球性公共衛生問題，然而慢性鋁中毒如何影響學習和記憶的機制尚未完全闡明，造成了慢性鋁中毒防治的困難。為此，本實驗通過建立慢性鋁中毒小鼠動物模型，測試小鼠的學習和記憶能力，以及測定大腦皮層乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)含量、β-內啡肽(β-endorphin，β-EP)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，研究慢性鋁中毒小鼠學習記憶的影響與大腦皮層ACh、β-EP、SOD和MDA的關系，探討鋁中毒小鼠導致認知能力障礙的機制，為慢性鋁中毒的預防提供理論基礎和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級KM小鼠32只，雌雄各半，3月齡，小鼠體重20 ～ 22 g，由右江民族醫學院提供[SCXK (桂) 2017-0003]。小鼠飼養于右江民族醫學院實驗動物中心[SYXK (桂) 2017-0004]，飼養環境：室溫(23±2)℃，相對濕度為40% ～ 60%，自由進水。小鼠的組織取材于右江民族醫學院應用生理研究室進行。

1.2 主要試劑與儀器

三氯化鋁(AlCl3)(天津市大茂化學試劑廠)；小鼠β-內啡肽試劑盒購于Sigma公司；SOD試劑盒、MDA試劑盒、ACh試劑盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。UV-1700紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，FSH-2可調高速勻漿機(江蘇省金壇市宏華儀器廠)，Y型迷宮刺激器(MG-B，張家港市教學實驗器械廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組和鋁中毒模型建立[5-6]

32只KM小鼠，隨機分為四組，分別是正常對照組、低劑量鋁中毒組、中劑量鋁中毒組、高劑量鋁中毒組，每組均為8只小鼠，各組小鼠雌雄各半，雌雄分籠飼養。正常對照組普通飼料飼養三個月；各劑量鋁中毒組均用16 g/L濃度的AlCl3水溶液拌入飼料中喂養小鼠，低劑量鋁中毒組每天按1.2 mg/kg體重劑量、中劑量鋁中毒組每天按12 mg/kg體重劑量、高劑量鋁中毒組每天按120 mg/kg體重劑量喂養小鼠，每天先喂完拌有AlCl3的飼料后再喂普通飼料，保證各組鋁的攝入量，各劑量鋁中毒組連續攝入鋁三個月。本研究所涉及的動物實驗均經過右江民族醫學院倫理委員會批準，并嚴格執行實驗動物安全制度及相關規章。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.3.2 小鼠學習記憶能力測試

各組小鼠的學習和記憶行為能力用Y型迷宮刺激器進行檢測。按文獻[7-8]的實驗方法和學會標準，將小鼠達到學會標準時所需的測試次數，作為大鼠學習行為能力的檢測指標。學習能力檢測24 h后，依照上述方法對小鼠連續進行20次測試，記錄小鼠在20次測試中的錯誤次數，作為小鼠記憶行為能力的檢測指標。

1.3.3 小鼠大腦皮層ACh、β-EP、SOD和MDA含量測定

各組小鼠在三個月后斷頭處死取出腦組織，快速剝離出大腦皮層，用生理鹽水制作成10%的勻漿，取勻漿的上清液分別測定大腦皮層中ACh含量、β-EP含量、SOD活性和MDA含量，各指標的測試步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 慢性鋁中毒小鼠學習和記憶測試結果

單因素方差分析顯示，各組間小鼠學習測試次數和記憶錯誤次數差異均有顯著性(分別為F=18.96，P< 0.01；F=25.99，P< 0.01)。中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠學習測試次數比對照組均明顯增多，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠學習測試次數比低劑量組也明顯增多；低劑量、中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠記憶錯誤次數比對照組均明顯增多，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠記憶錯誤次數比低劑量組也明顯增多；差異均有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。詳見表1。

表1 慢性鋁中毒小鼠學習和記憶測試結果Table 1 Learning and memory abilities of mice with chronic aluminum toxicities

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與低劑量組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.2 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中ACh和β-EP含量

單因素方差分析顯示，各組間小鼠大腦皮層ACh和β-EP含量差異均有顯著性(分別為F=10.05，P< 0.01；F=6.53，P< 0.01)。中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層ACh含量比對照組明顯降低，高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層ACh含量比低劑量組也明顯降低；低、中、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層β-EP含量比對照組明顯降低，高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層β-EP含量比低劑量組明顯降低；差異均有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。詳見表2。

表2 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中ACh和β-EP含量測定結果Table 2 ACh and β-EP levels in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與低劑量組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.3 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中SOD活性和MDA含量的測定結果

單因素方差分析顯示，各組間大腦皮層SOD活性和MDA含量差異均有顯著性(分別為F=10.60，P< 0.01；F=7.16，P=0.01)。與對照組相比較，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層SOD活性均明顯降低，而中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層MDA含量均升高，差異均有顯著性(P< 0.01或P< 0.05)；與低劑量組相比較，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層SOD活性均降低，而高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層MDA含量升高，差異有顯著性(P< 0.01或P< 0.05)。詳見表3。

表3 慢性鋁中毒小鼠大腦皮層中SOD活性和MDA含量的測定結果Table 3 SOD and MDA levels in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與低劑量組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the low-dose group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.4 慢性鋁中毒小鼠學習和記憶與大腦皮層神經遞質及自由基的相關性分析

Pearson相關性分析顯示，中劑量、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層中ACh、β-EP和SOD均與相應同劑量組學習測試次數和記憶錯誤次數均呈負相關(P< 0.05或P< 0.01)；高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層中MDA含量與同劑量組學習測試次數和記憶錯誤次數均呈正相關(P< 0.05或P< 0.01)。詳見表4。

表4 慢性鋁中毒小鼠學習和記憶與大腦皮層神經遞質及自由基的相關性分析(n=8)Table 4 Correlation analysis between learning and memory abilities and the levels of ACh, β-EP, SOD, and MDA in the cerebral cortex of mice with chronic aluminum toxicities

3 討論

學習與記憶是兩個有聯系的神經活動過程，是動物和人類中樞神經系統的高級功能活動。迄今為止，有關學習和記憶的機制仍不十分清楚。已有研究表明，學習和記憶力與神經系統中的神經遞質乙酰膽堿密切相關[9-12]，腦內乙酰膽堿有促進學習和記憶的作用；阿片肽是神經肽的主要成員，內啡肽屬于阿片肽中的一族，內啡肽中主要是β-內啡肽，有研究報道，β-內啡肽可易化記憶[13 -14]，其作用與給藥劑量和給藥時間呈明顯相關性，但也有人認為β-內啡肽可損害記憶能力[15]。

本研究結果發現，各劑量鋁中毒組小鼠學習訓練次數和記憶錯誤次數均高于正常對照組，且學習訓練次數和記憶錯誤次數增多的幅度隨著鋁中毒劑量的增高而增多，這說明慢性鋁中毒可致小鼠學習和記憶能力下降，這與文獻報道[4, 16]一致。本研究結果還顯示，各劑量鋁中毒組小鼠學習測試次數和記憶錯誤次數增加的同時，其大腦皮層乙酰膽堿和β-內啡肽的含量反而明顯低于對照組，且小鼠學習記憶能力明顯下降，大腦皮層乙酰膽堿和β-內啡肽也隨之明顯降低，呈現了一定的劑量效應關系；通過Pearson相關性分析顯示，中、高劑量鋁中毒組小鼠大腦皮層中乙酰膽堿和β-內啡肽均與相應同劑量組學習測試次數、記憶錯誤次數均呈負相關，這說明大腦皮層中乙酰膽堿和β-內啡肽參與學習和記憶的神經遞質，大腦皮層中乙酰膽堿和β-內啡肽均有促進學習和記憶的作用，與文獻報道[12-13]一致。

超氧化物歧化酶(SOD)是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫的酶，在保護細胞免受氧自由基的毒害中發揮著重要作用；自由基攻擊膜脂中的不飽和脂肪酸，使其發生氧化，脂質過氧化產物丙二醛(MDA)就會升高。本研究結果表明，中、高劑量鋁中毒組大腦皮層SOD活性均明顯降低，而中、高劑量鋁中毒組大腦皮層MDA含量均升高；高劑量組小鼠大腦皮層中SOD與學習測試次數和記憶錯誤次數均呈負相關；而MDA含量與學習測試次數和記憶錯誤次數呈正相關。慢性鋁中毒使鋁在體內腦、骨、肝等多個組織器官中蓄積，特別鋁可以通過血腦屏障進入腦組織產生神經行為毒性作用[17-18]。進入腦組織內的鋁可引起大腦皮層脂質過氧化增強和產生自由基增多[19-20]，氧自由基引起的DNA損傷可激活p53基因，氧自由基的氧化應激可活化核轉錄因子NF-kB和Caspase基因家族等途徑，可加速細胞凋亡相關基因的表達，引起神經細胞凋亡。因此，鋁中毒后導致小鼠神經細胞凋亡增加，從而使小鼠學習記憶受到損傷[21-22]。

綜上所述，不同劑量鋁中毒可引起小鼠認知功能障礙，鋁中毒可能通過降低大腦皮層中乙酰膽堿、β-內啡肽和SOD含量，升高MDA含量，進而影響小鼠學習與記憶能力，這可能是鋁中毒致小鼠認知能力障礙的機制之一。但其具體的機制還有待于進一步研究和探討。