七氟醚對新生大鼠神經干細胞的增殖作用

黃劍峰，冼海燕，侯小瓊

(1.廣西醫科大學第二附屬醫院手術麻醉科，南寧 530000； 2.廣西醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，南寧 530021)

七氟醚因起效迅速，可控性好，氣道刺激性小等優點，是目前兒科麻醉中應用最為廣泛的吸入麻醉藥。最近的研究表明常用的吸入全麻藥暴露對中樞神經系統均有不同程度的毒害作用，嬰幼兒大腦從孕中期開始至出生后的幾年處于發育關鍵時期，容易受到外界不良因素的影響。研究表明長時間暴露于七氟醚會誘導發育期動物大腦神經細胞凋亡，影響神經系統發育，導致遠期的學習認知功能障礙[1-4]。神經干細胞都具備分化成為神經元等神經系統各種不同細胞的潛能。內源性神經干細胞主要分布于腦室/腦室下區(ventricular/subventricular zone，VZ/SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層等部位，并且神經發生從發育期一直持續到成年[5]。目前大量研究主要集中在七氟醚對神經元的損傷作用和機制，但對神經元的前體神經干細胞的影響研究較少，本研究擬從神經干細胞增殖角度探討七氟醚中樞神經系統毒性的發生及防治機制，為全麻藥物神經毒性的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗選用初生7 d雄性SD大鼠48只，清潔級，體重15 ～ 20 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心[SCXK (桂) 2016-0054]。動物實驗經由實驗動物管理委員會批準(2016-0113)，在實驗動物中心屏障動物實驗設施進行[SYXK (桂) 2016-0037]，實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(美國Baxter Healthcare公司)，BSA封閉液、顯影定影試劑盒、TBST緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液(北京索萊寶生物技術有限公司)，Nestin、Cyclin D1、Smad4、BMP2單克隆抗體(美國Abcam公司)，β-actin、FITC綠色熒光二抗及DyLight 594紅色熒光二抗(北京中杉金橋生物生物技術有限公司)，兔多抗BrdU(美國Accurate Chemical)。切片機(德國Leica CM1900)，熒光顯微顯微鏡(日本Olympus BX61)，病理圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及分組

將動物隨機分為3組，每組16只，即對照組(Con組)、1%七氟醚組(S1組)、3%七氟醚組(S2組)。在麻醉氣體揮發罐中加入適量液態七氟醚，將氧氣罐的輸出端連接至小動物麻醉機的入口處，麻醉機出口接至麻醉誘導箱中，溫度控制在(37±2)℃。將動物放入麻醉誘導箱中，開通氣閥，使氧氣罐中的氧氣攜帶揮發罐中的七氟醚進入麻醉誘導箱中，從而使動物麻醉。調整七氟醚的濃度，2 L/min流量，麻醉持續4 h。麻醉終止后6 h，處死大鼠，于冰上迅速離出大腦，切取額葉內含腦室區(VZ)和腦室下區(SVZ)的腦組織。

1.3.2 Nestin/BrdU雙標檢測神經干細胞增殖

采用免疫熒光染色法，鼠腦冷凍好后，將其在切片機內固定好，切片厚度20 μm，將貼好的腦片放于片盒內保存在-20℃內。腦片在TBS溶液中進行水化，放置于室溫下15 min，吸干腦片周圍的水分，加入鼠單抗Nestin(1∶200)和兔抗鼠BrdU(1∶200)混合，4℃過夜；棄掉一抗，PBS洗5 min。FITC標記的熒光二抗(1∶200)和DyLight 594紅色的熒光二抗(1∶400)加到載玻片的組織上，室溫孵育2 h，PBS清洗，用濾紙吸干組織周圍水分，滴加一滴稀甘油，蓋片。將制備好的玻片放置在熒光微鏡400倍下觀察，每組隨機選取5個視野，雙標Nestin/BrdU陽性細胞數與Nestin陽性細胞數目比值為神經干細胞增殖率(%)。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達

蛋白裂解液處理各組樣品，使用超聲破碎儀低溫裂解3次，每次30 s，離心(4℃，12 000 r/min，10 min)，取上清測定蛋白濃度，配平各組蛋白濃度，蛋白變性，經SDS-PAGE分離電泳后轉膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，Nestin(1∶500)、Cyclin D1(1∶1000)、Smad4(1∶1000)、BMP2(1∶500)4℃冰箱過夜，棄掉一抗，TBST洗膜5 min，3次；將膜轉入雜交袋，室溫孵育二抗(1∶10 000)2 h，棄掉二抗，TBST洗膜5 min，3次；ECL系統顯影，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定條帶的灰度值，以目標蛋白與β-actin灰度值之比表示目標蛋白的表達水平，實驗重復3次。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 七氟醚麻醉對Nestin蛋白表達的影響

Nestin蛋白表達，S1組(0.54±0.04)和S2組(0.43±0.06)均低于對照組(0.61±0.06)，其中S2組中Nestin蛋白表達與對照組相比差異有顯著性(P< 0.05)。結果見圖1。

圖1 七氟醚麻醉對新生鼠腦組織Nestin蛋白表達影響(n=6)Figure 1 Effects of sevoflurane anesthesia on protein expression of Nestin in the brain of neonatal rats

2.2 七氟醚麻醉降低的新生鼠神經干細胞增殖

對照組中Nestin/BrdU雙陽性細胞數目所占Nestin陽性細胞百分比為(41.3±6.7)%，S1組和S2組雙陽性細胞百分比分別為(25.6±7.2)%和(17.4±5.9)%。與對照組比較，S1組和S2組神經干細胞增殖率降低，差異均有顯著性(P< 0.05)，結果見圖2。

表1 七氟醚麻醉對新生鼠腦組織中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表達影響Table 1 Effects of sevoflurane on protein expression of Cyclin D1, Smad4, and BMP2 in brain tissue of neonatal rats

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：標尺=50 μm。圖2 七氟醚對新生鼠神經干細胞增殖影響(n=6)Note. Bars=50 μm.Figure 2 Effects of sevoflurane on the proliferation of neonatal rat neural stem cells

2.3 七氟醚麻醉影響新生鼠腦組織中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表達

與對照組比較，S1組和S2組細胞內Cyclin D1的表達下調(P< 0.05)。與對照組比較，S1組和S2組Smad4和BMP2表達增高，差異均有顯著性(P< 0.05)，結果見圖3和表1。

圖3 七氟醚對新生鼠腦組織中Cyclin D1、Smad4和BMP2蛋白表達影響(n=6)Figure 3 Effects of sevoflurane on protein expression of Cyclin D1, Smad4, and BMP2 in brain tissue of neonatal rats

3 討論

七氟醚作為臨床廣泛使用的吸入麻醉藥，對未成熟神經系統的損傷已引起廣泛關注。已研究表明七氟醚麻醉出生7 d小鼠6 h，引起海馬和前額皮質等多個腦區神經元調亡[6]。神經元是由神經干細胞分化而來，七氟醚麻醉對神經干細胞是否有不良作用，目前尚不清楚。胚胎時期許多部位都存在神經干細胞，終生存于VZ/SVZ區、海馬齒狀回、大腦皮層等部位。其高度自我更新能力，維持自身數目的穩定和干細胞的特性。Nestin作為神經干細胞的標記物，有調節神經細胞增殖，分化成熟作用，隨著神經干細胞完成遷移和分化，Nestin表達逐漸減少甚至消失。通過Western blot檢測不同組別Nestin表達情況發現，七氟醚處理后，Nestin表達出現下降趨勢，說明內源性神經干細胞數量是減少的。

大腦發育處于未成熟階段，容易受外界不良因素影響神經干自我更新、增殖和分化能力。如果干細胞在本該保留增殖能力的階段脫離了細胞周期，就會沒有足夠的神經干細胞產生新的神經元維持神經發育的后期階段，導致神經發生的異常[7]。BrdU常用于標記活細胞中新合成的DNA，隨著DNA復制進入子細胞中，判斷細胞的增殖能力。BrdU與Nesin雙標檢測神經干細胞增殖率發現，S1組和S2組VZ區和SVZ區神經干細胞增殖率低于對照組，這與以往的研究類似[8]。以上結果說明，七氟醚對新生鼠神經干自我更新的能力具有干預作用。研究中發現，對照組的Nestin陽性細胞主要集中在VZ區和緊鄰該區的SVZ區，S1組Nestin陽性細胞減少主要是在VZ區，在SVZ區并無明顯減少，且Nestin陽性細胞還有向SVZ區遠端擴展趨勢；S2組Nestin陽性細胞減少也主要是在VZ區，以及鄰近VZ區的SVZ區，SVZ區遠端仍保持較高的Nestin陽性細胞。目前仍不清楚為何出現此現象，尚需進一步研究。

Cyclin D1是細胞周期調控蛋白，Cyclin D1基因敲除，抑制了在體海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區和SVZ區神經干細胞的增殖，同時誘導神經干細胞走向凋亡[9-10]。Cyclin D1基因過表達可促進神經干細胞的增殖[11]。本研究結果表明，與對照組比較，S1組、S2組腦組織中Cyclin D1蛋白表達下調，提示七氟醚誘發增殖抑制的機制與下調腦組織Cyclin D1有關。

BMP2屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成員，其信號通路參與神經干細胞增殖和分化的作用[12]。BMP2及其受體發揮作用主要通過Smad介導的轉導途徑實現[13-14]。在信號轉導過程中，細胞外的BMP2與細胞膜表面的BMPRⅠ、BMPRⅡ結合形成復合物，BMPRⅡ磷酸化后，再激活BMPRⅠ而形成活化的復合物，然后引起Smad磷酸化而激活，活化的Smad發生構象改變，從受體上游離，與細胞質中的Smad1/4結合，共同轉位入細胞核中，轉錄Cyclin D1，進而調節細胞的增殖與凋亡[12,15]。本實驗結果中七氟醚處理后，BMP2和Smad4表達增強，而Cyclin D1表達降低，神經干細胞增殖率降低。已有報道全麻藥物可抑制發育期大腦神經干細胞與神經元的増殖，神經細胞增殖減少可影響認知功能[16]，與本研究結果相似，推測此七氟醚可能影響了神經細胞的增殖。

綜上所述，七氟醚麻醉新生大鼠導致VZ/SVZ區Nestin表達下降，干細胞增殖活性降低，該變化和腦內Cyclin D1信號下調、BMP2和Smad4水平上調有關。