SIVmac239病毒感染CEMx174細胞過程分析

李 想，童 玲，叢 喆，薛 婧

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，衛計委人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

獲得性免疫缺陷綜合征是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的人類免疫系統缺陷疾病。HIV感染細胞主要包括三個步驟：黏附、融合和進入[1]。早期研究發現，HIV的主要細胞受體為CD4分子，HIV首先附著在細胞表面的CD4分子上，然后融合進入細胞[2-3]。猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)是從靈長類動物身上分離得到的類似于HIV的病毒，SIV恒河猴模型被認為是研究艾滋病最有效的模型，而SIVmac239是常用的SIV病毒[4]。因此，為觀察病毒吸附和感染細胞的全過程，本研究使用SIVmac239病毒感染CEMx174細胞，通過運用不同的技術方法，觀察病毒與CEMx174細胞的吸附，以及病毒感染細胞的整個過程。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病毒株

感染毒株為SIVmac239，由美國Aaron Diamond艾滋病研究中心Preston Marx博士惠贈。使用CEMx174細胞擴增制備，TCID50為3 × 105/mL。

1.1.2 細胞

CEMx174細胞，由本實驗室保藏。懸浮生長，生長速度較快，按照1∶5傳代培養，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養液，置于37℃、5% CO2孵箱中培養。

1.2 主要試劑與儀器

Anti-monkey IgG-FITC antibody(貨號：F3839-1ML)購自美國Sigma公司，goat anti-mouse IgG FITC conjugate(貨號：010300002)購自愛博生公司，小鼠抗SIV p27 Western blot單克隆抗體(克隆號：3G3)由本實驗室制備[5]，小鼠抗SIV p27流式抗體(克隆號：4D5)由愛博生生物技術有限公司制備，IC fixation buffer(貨號：00-8222-49)和10×permeabilization buffer(貨號：00-8333-56)購自eBioscience公司。BD AccuriTMC6流式細胞儀，Leica激光共聚焦掃描顯微鏡，ABI 7500實時熒光定量PCR儀，Bio-Rad電泳儀，Tanon化學發光分析系統，Nikon倒置顯微鏡，日本Hitachi CF16RXⅡ高速離心機，Dynamica臺式離心機，ESCO生物安全柜，Thermo Forma二氧化碳恒溫培養箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 病毒吸附及感染

取2 mL濃度為每毫升1 × 106個的CEMx174細胞加入六孔板中，每孔加入40 μL SIVmac239病毒，將細胞與病毒懸液混勻后置于4℃吸附30 min，吸附結束后，10 mL完全培養液漂洗3次，4℃、2000 r/min離心3 min，棄上清，添加新的培養液37℃、5% CO2孵箱中繼續培養。

1.3.2 樣本的收集與處理

CEMx174吸附病毒后，分別在0.5，12，24，48，72，96 h時，取細胞培養上清，提取病毒RNA，real-time PCR檢測病毒載量的變化；離心后的細胞，一部分用于制備細胞涂片，IFA檢測并用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察病毒定位及復制情況；一部分用于胞內流式，檢測細胞內病毒蛋白p27含量的變化；其余細胞進行裂解，提取蛋白，利用Western blot檢測細胞內病毒蛋白p27表達量的變化。

1.3.3 培養上清中病毒載量的檢測[6-7]

收取不同感染時間的培養上清，運用TRIzol法提取培養上清中的病毒RNA，根據SIVgag基因的保守序列設計引物，利用real-time PCR測定培養上清中的病毒RNA，實驗步驟詳見參考文獻[6-7]。

1.3.4 IFA檢測SIVmac239病毒抗原[8]

將收取的細胞用PBS洗兩次后，調整至合適的細胞濃度，涂于玻片孔中干燥后冰丙酮固定30 min。SIV感染猴血漿滅活后用PBS(1∶20)稀釋，滴加至玻片孔中，將滴加完成的玻片放入濕盒內，37℃孵育30 min。孵育結束后，取出玻片，PBS漂洗3次，每次浸泡5 min，其間輕輕震搖數次。用紙巾拍干，加入PBS稀釋的anti-monkey IgG-FITC antibody(1∶400)，滴加完成后放入濕盒，37℃孵育30 min。孵育結束后，PBS漂洗3次，每次浸泡5 min，其間輕輕震搖數次。紙巾拍干，DAPI封片后，即可在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結果。

1.3.5 胞內流式檢測SIVmac239病毒p27蛋白[9]

收取細胞，每管1 × 106個細胞，加入100 μL IC fixation buffer于4℃固定20 min，加入2 mL 1× permeabilization buffer于4℃、2000 r/min離心3 min，洗2次后100 μL重懸細胞，加入1 μg SIV p27流式抗體，4℃孵育30 min。孵育結束洗2次后，100 μL重懸細胞，加入2 μg goat anti-mouse IgG FITC conjugate，4℃孵育30 min。孵育結束后，分別用2 mL 1× permeabilization buffer洗2次和2 mL PBS洗1次，適量PBS重懸細胞后流式儀檢測p27表達量。

1.3.6 Western blot檢測CEMx174細胞中p27蛋白表達[5]

病毒感染細胞后不同時間點收取細胞，用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白的濃度。取30 μg總蛋白100℃變性后，12% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至NC膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉，小鼠抗SIV p27單克隆抗體用封閉液1∶2000稀釋后，4℃孵育過夜。二抗為辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠抗體，內參用辣根過氧化物酶偶聯的β-actin抗體，均用TBST 1∶15 000稀釋，室溫孵育1 h，加入酶作用底物顯影后，凝膠成像分析系統掃描分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 SIVmac239感染CEMx174過程中的細胞病變

SIVmac239感染CEMx174細胞后48 h即可出現個別明顯的細胞病變——多細胞融合形成巨大的融合泡(圖1B)；到感染后96 h時，細胞病變嚴重，出現大量的晚期細胞融合泡，泡內細胞結構消失甚至融合泡破裂，內容物溢出(圖1C)。

注：A：正常CEMx174細胞(× 20)；B：SIVmac239感染48 h時的CEMx174細胞(× 20)；C：SIVmac239感染96 h時的CEMx174細胞(× 20)。箭頭指示細胞病變。圖1 SIVmac239病毒感染CEMx174細胞后的細胞病變Note. A: Uninfected CEMx174 cells (× 20); B: CPE of CEMx174 cells at 48 hours post-infection by SIVmac239 (× 20); C: CPE of CEMx174 cells at 96 hours post-infection of SIVmac239 (× 20). Arrows indicate the cytopathic effect.Figure 1 Cytopathic effect (CPE) in CEMx174 cells infected by SIVmac239

2.2 SIVmac239感染CEMx174細胞過程中培養上清病毒載量的變化

SIVmac239病毒在4℃吸附細胞CEMx174 0.5 h后，檢測上清中病毒載量，結果顯示，上清中的病毒RNA水平為每毫升1 × 104.5拷貝，病毒感染細胞12 h時培養上清中病毒載量下降，為每毫升1 × 104拷貝，此后至病毒感染細胞96 h，培養上清中的病毒RNA水平持續升高至每毫升1 × 109拷貝。如圖2所示。

圖2 SIVmac239感染CEMx174細胞過程中培養上清病毒載量的變化Figure 2 Viral RNA level in culture supernatants of SIVmac239-infected CEMx174 cells

2.3 使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測SIVmac239感染CEMx174細胞的過程

SIVmac239病毒4℃吸附細胞CEMx174 0.5 h后，細胞膜上檢測到綠色點狀熒光，綠色點狀熒光所在的位置即為病毒所在的位置(圖3B)。病毒感染細胞12，24，48 h時，在細胞膜上均觀察到綠色點狀熒光。感染至第72 h和第96 h時，細胞胞漿內檢測到大量的綠色點狀熒光(圖3C、3D)，呈現新月狀、戒指狀或圓環狀。

2.4 SIVmac239感染CEMx174過程中胞內p27蛋白表達量的變化

SIVmac239感染CEMx174細胞后，胞內流式和蛋白質免疫印跡檢測細胞內病毒蛋白p27的表達。胞內流式結果顯示感染至第24 h時，可以檢測到病毒蛋白p27，但與感染第12 h相比，無明顯變化。感染至第48 h時，表達病毒蛋白p27的細胞所占百分比為(1.05±0.10)%，比例明顯增加(P< 0.01)；

注：A：正常CEMx174細胞(× 63)；B ～ D：SIVmac239病毒感染細胞0.5，72，96 h時抗原檢測(× 63)。箭頭所指的點狀綠色熒光，即為病毒所在的位置。圖3 IFA檢測感染SIVmac239病毒的CEMx174細胞內的病毒抗原Note. A: Uninfected CEMx174 cells (× 63); B-D: Detection of the antigen on cells at 0.5, 72, and 96 h post-infection by SIVmac239 (× 63). The green fluorescence dot pointed by the arrow indicates the location of the virus.Figure 3 IFA showing the virus antigen in SIVmac239-infected CEMx174 cells

注：A、B：胞內流式檢測不同時間細胞內p27的變化；C：蛋白質免疫印跡檢測病毒感染細胞0.5，12，24，48，72 h及96 h p27蛋白表達量的變化。感染48 h時與正常對照組相比，** P< 0.01。圖4 SIVmac239感染的CEMx174細胞內p27蛋白表達量的變化Note. A, B: Intracellular cytokine staining (ICS) shows the expression of SIV p27 in different times. C: The expression of SIV p27 in CEMx174 cells 0.5, 12, 24, 48, 72 and 96 hours post infection of SIVmac239. Compared with normal control group when infected with 48 h,** P < 0.01.Figure 4 Change in the expression of SIV p27 in SIVmac239-infected CEMx174 cells

此后至感染第96 h，表達SIV p27的細胞所占的比例逐漸升高，至第96 h時所占的比例為(19.75±0.64)%(圖4A、4B)。

蛋白質免疫印跡陰性對照為未感染病毒的正常CEMx174細胞，在1 ～ 7泳道內參蛋白條帶灰度大致相同的情況下，檢測細胞胞漿中的p27蛋白。病毒吸附感染細胞0.5 ～ 24 h細胞胞漿中未能檢測到病毒蛋白p27，在病毒感染CEMx174細胞48 h時開始檢測到病毒蛋白p27，并且在之后的48 h，細胞胞漿中的SIV p27表達量呈逐漸遞增的趨勢(圖4C)。

3 討論

早期研究發現，HIV在感染細胞時首先黏附在細胞上，然后再進入細胞[10]。為觀察病毒吸附細胞及病毒感染細胞的全過程，本研究用SIVmac239病毒感染CEMx174細胞，運用不同的技術方法，觀察病毒與細胞吸附以及病毒感染細胞的全過程。

本研究中，SIVmac239病毒4℃吸附細胞0.5 h后，間接免疫熒光法檢測病毒的定位，結果顯示，細胞膜上檢測到病毒顆粒，表明病毒在感染細胞時，首先吸附在細胞膜上，但是檢測到的吸附在細胞膜上的病毒顆粒較少，說明雖然在吸附感染時加入的病毒量很大，但是能有效吸附細胞的病毒較少。在對培養上清中的病毒RNA進行檢測時發現，SIVmac239病毒吸附感染細胞第0.5 h至第96 h，培養上清中均能檢測到病毒RNA，病毒感染細胞12 h后，培養上清中的病毒載量下降，但是與加入的病毒相比下降不明顯，從而可知，病毒在感染細胞時，能真正感染細胞的病毒較少，推測一定量的細胞在被病毒感染時，能感染細胞的病毒具有最大量，當病毒的量超出最大限度時，超出部分的病毒將無法感染細胞。在檢測病毒的核心蛋白p27時，病毒感染細胞第24 h時，胞內流式即可檢測到病毒蛋白p27，而Western blot在病毒感染細胞48 h時開始檢測到病毒蛋白p27，此后至病毒感染細胞96 h，SIV核心蛋白p27表達量逐漸升高，與培養上清中的病毒RNA、間接免疫熒光檢測病毒復制情況的變化趨于一致。

綜上所述，SIVmac239感染細胞CEMx174時，病毒首先吸附在細胞膜上，然后進入細胞，從感染后第12 h隨著感染時間的增加，培養上清中病毒RNA水平持續升高，病毒持續復制，細胞內病毒核心蛋白p27的表達量逐漸增加。另外，檢測水平和實驗方法不同，使實驗結果出現不同程度的差別，可根據實驗的目的和需要，選擇合適的檢測水平和實驗方法。