經導管局部灌注紫杉醇模擬藥物涂層球囊預防小型豬髂總靜脈狹窄的實驗研究

魯景元，徐文健，施萬印，顧建平*

(1.南京醫科大學附屬婦產醫院(南京市婦幼保健院)介入科，南京 210004； 2.南京醫科大學附屬南京醫院介入科，南京 210006)

藥物涂層球囊(drug-coated balloon，DCB)最早用于治療冠狀動脈狹窄性病變[1]，此后逐步向外周動脈狹窄性病變的治療中推廣[2]，國外近期有將DCB應用于肺靜脈狹窄[3]及中心靜脈狹窄[4]治療的報道，但將DCB用于外周靜脈狹窄性病變治療的動物實驗及臨床研究罕見。參閱相關文獻[5-9]，本研究采用“雙球囊封堵注藥”的方法模擬DCB的作用，并通過動物實驗探討DCB對于外周靜脈狹窄性病變的治療價值，在目前具有一定的創新性和現實意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

取6 ～ 8月齡、體重16 ～ 20 kg的雄性普通級實驗用巴馬小型豬20頭，隨機分入實驗組(n=10)和對照組(n=10)。實驗前兩組均禁食12 h，禁飲4 h。實驗動物由上海市浦東新區老港鎮華新特種養殖場實驗豬繁育與實驗研究基地提供[SCXK (滬) 2012-0013]。實驗用巴馬小型豬飼養于普通級半開放式豬舍[SYXK (蘇) 2016-0006]。本實驗經南京醫科大學實驗動物倫理委員會批準，倫理審批編號[201607-029]。本實驗全過程中，充分尊重“動物福利”，以動物實驗的“3R原則”為指導，最大限度地給予實驗動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

氯胺酮、戊乙奎醚、丙泊酚、碘佛醇、碘普羅胺、紫杉醇注射液、注射用頭孢拉定等。醫用血管造影X射線機：Artis Zee，Siemens公司；血管鞘組、超滑導絲、交換導絲、血管內造影導管，Terumo公司；球囊擴張導管：Cordis PowerflexTMP3(6 mm、8 mm)，Johnson & Johnson公司；壓力泵：EncoreTM26 Inflator，Boston Scientific公司；徠卡切片及組織包埋系統；Gudien(固迪安)大動物尸體解剖臺。

1.3 實驗方法

1.3.1 麻醉和建模

氯胺酮8 mg/kg +戊乙奎醚0.02 mg/kg頸后肌內注射，同時給予流量5 L/min面罩吸氧，并經耳緣靜脈持續泵入氯胺酮5 mg/(kg·h) +丙泊酚5 mg/(kg·h)維持麻醉。麻醉滿意后選擇1.3∶1的過大球囊[10]擴張擬處理段髂總靜脈，造成靜脈內、中膜機械性損傷。

1.3.2 模擬藥物涂層球囊

實驗組小型豬，撤出建模用球囊導管后，經股靜脈鞘在導絲引導下置入一枚球囊導管(球囊1)，使球囊1頭端位于之前處理段靜脈遠心端。之后，行經皮頸靜脈穿刺或頸靜脈切開穿刺(經皮穿刺困難時)，置入5F血管鞘。經導絲引導，置入另一枚球囊導管(球囊2)，球囊2頭端位于處理段靜脈近心端。遠心端及近心端球囊直徑選擇與該處所測量靜脈內徑相等或略大(1∶1 ～ 1.1∶1)，該兩處球囊起封堵靜脈血流，延長紫杉醇與處理段血管壁作用時間的作用。壓力泵分別充盈球囊1及球囊2，并經球囊1導管腔在透視下緩慢推注紫杉醇與碘普羅胺的混合溶液，紫杉醇的濃度約為4 mg/mL，推注持續時間為120 s。模式圖及X線造影圖像，見圖1、圖2。推注結束后，依次排空并撤出球囊1及球囊2，并拔出股靜脈及頸靜脈鞘管。對照組不行以上操作。

圖1 經導管向小型豬髂總靜脈局部灌注紫杉醇模擬DCB模式圖Figure 1 Pattern diagrams of simulated drug-coated balloons with local perfusion of paclitaxel into the common iliac vein of miniature pigs

圖2 經導管向小型豬髂總靜脈局部灌注紫杉醇模擬DCB靜脈造影圖像Figure 2 Venography image of simulated drug-coated balloons with local perfusion of paclitaxel into the common iliac vein of miniature pigs

1.3.3 小型豬術后管理

小型豬麻醉復蘇后，送回動物實驗中心，兩組均給予常規飼料喂養，同時予10 mg/kg劑量的頭孢拉定注射液行臀大肌注射，連用3 d。每日喂食兩次，日投喂量為體重的2%，清潔水飲用無限制。實驗組和對照組小型豬術前、術后2周抽取靜脈血標本(抽血前禁食12 h)評估肝腎功能變化；術前及術后2月行髂總靜脈X線造影檢查，觀察髂總靜脈管腔狹窄情況并測量其內徑；術后2月造影檢查后，空氣栓塞處死小型豬，解剖分離髂總靜脈標本，HE染色后，鏡下觀察處理段髂總靜脈管壁病理學改變。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 小型豬一般情況

20頭小型豬中，1頭麻醉過程中死亡，1頭建模操作過程中死亡，1頭死于術后飼養過程中，其余17頭均存活至實驗終點。實驗組(n=9)對比對照組(n=8)，體重[(17.7±1.17) kg vs. (17.4±1.40) kg，P=0.631]、月齡[(7.16±0.40)月vs. (7.14±0.39)月，P=0.933]。兩組體重及月齡差異均無顯著性(P> 0.05)。

2.2 小型豬肝腎功能指標變化

實驗組術前對比術后2周、實驗組術后2周對比對照組術后2周，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，Cr)及血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)差異均無顯著性(P> 0.05)。見表1、表2。

表1 實驗組術前與術后2周肝腎功能指標對比Table 1 Comparison of liver and kidney function indices in the experimental group between preoperative and 2 weeks after operation

注：術后2周與術前對比，P> 0.05。

Note. Two weeks after operation compared with preoperative,P> 0.05.

表2 實驗組與對照組術后2周肝腎功能指標對比Table 2 Comparison of liver and kidney function indices between the experimental group and control group at 2 weeks after operation

注：實驗組與對照組對比，P> 0.05。

Note. The experimental group compared with the control group,P> 0.05.

注：A：術前小型豬髂總靜脈X線造影，管腔內壁光整；B：術后2月小型豬髂總靜脈X線造影，管腔輕度狹窄(< 30%)，管壁稍毛糙；C：術后2月小型豬髂總靜脈X線造影，管腔中度狹窄(≥ 30%，< 70%)；D：術后2月小型豬髂總靜脈X線造影，管腔重度狹窄(≥ 70%)。圖3 髂總靜脈造影圖像Note. A: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs before operation showed smooth vascular cavity inner walls. B: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs two weeks after operation showed narrowing of the lumen (< 30%) and slight hardening of the vascular wall. C: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs two weeks after operation showed moderate narrowing of the lumen (≥ 30%, < 70%). D: X-ray radiography of the common iliac vein in miniature pigs two weeks after operation showed severe narrowing of the lumen (≥ 70%).Figure 3 Venography image of common iliac vein

2.3 小型豬髂總靜脈管腔內徑變化

小型豬術前及術后2月髂總靜脈造影圖像，見圖3。

實驗組術前對比實驗組術后2月管腔內徑[(5.08±0.43) mm vs. (3.74±1.24) mm，P< 0.05]；對照組術前對比對照組術后2月管腔內徑[(5.07±0.72) mm vs. (2.25±1.41) mm，P< 0.05]，兩組術后管腔內徑均較術前減少，說明建模是成功的。術前實驗組對比對照組管腔內徑[(5.08±0.43) mm vs. (5.07±0.72) mm，P> 0.05]；術后2月實驗組對比對照組管腔內徑[(3.74±1.24) mm vs. (2.25±1.41) mm，P< 0.05]，術前兩組管腔內徑無明顯差別，而術后2月對照組管腔較實驗組狹窄，說明模擬DCB能夠延阻靜脈管腔狹窄的進展。見表3。

表3 實驗組與對照組術前、術后2月處理段管腔內徑對比Table 3 Comparison of lumen diameter of the target vein in the experimental group and control group at preoperative and 2 weeks after operation

注：術后2周與術前對比，*P< 0.05；實驗組與對照組對比，△P< 0.05。

Note. Two weeks after operation compared with preoperative,*P< 0.05. The experimental group compared with the control group,△P< 0.05.

2.4 小型豬髂總靜脈管壁組織病理變化

術后2月，實驗組與對照組小型豬在完成造影檢查后，空氣栓塞法處死，解剖分離處理段及對側相同部位未處理髂總靜脈標本(空白對比)。經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及HE染色后，100倍、200倍光學顯微鏡下觀察并照相。光鏡下見：實驗組與對照組小型豬髂總靜脈管壁在過大球囊擴張后2月，內彈力膜均顯示不清，內膜、中膜界限模糊；與對側相同部位未處理髂總靜脈相比，實驗組與對照組處理段髂總靜脈內膜、中膜均增厚，且對照組增厚更明顯；對照組處理段髂總靜脈內、中膜的平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)數量和體積明顯多于實驗組，且細胞排列紊亂；實驗組與對照組外彈力膜均殘缺不完整，且對比差別不大。實驗組與對照組術后2月，小型豬髂總靜脈病理改變，見圖4。

注：A：對側髂總靜脈(× 200)，內、中膜完整，界限清晰；B：對照組髂總靜脈(× 200)，內、中膜增厚，中膜VSMCs增多紊亂；C：實驗組髂總靜脈(× 100)，內、中膜輕度增厚；D：對照組髂總靜脈(× 100)，內、中膜增厚伴大量淋巴細胞浸潤。圖4 小型豬髂總靜脈病理改變(HE染色)Note. A: In the contralateral common iliac vein, the internal and middle membranes were intact with clear boundaries (× 200). B: In the common iliac vein of the control group, the internal and middle membranes were thickened with increased VSMCs in the middle membrane (× 200). C: In the common iliac vein of the experimental group, the inner and middle membranes were slightly thickened (× 100). D: In the common iliac vein of the control group, the internal and middle membranes were thickened with considerable lymphocytic infiltration (× 100).Figure 4 Histological changes of common iliac vein of the miniature pigs. HE staining

3 討論

狹窄性病變不僅存在于外周動脈疾病的發生與發展過程中，其與外周靜脈疾病進程亦密切相關。髂靜脈[11]、鎖骨下靜脈[12]、移植器官靜脈[13]、透析道靜脈[14]等的原發及治療后再狹窄發生率并不低。然而，目前針對外周靜脈狹窄發生機制的研究遠不如針對外周動脈的研究深入。

利用過大球囊擴張小型豬髂總靜脈，造成靜脈管壁的機械性損傷，而損傷修復過程是形成靜脈管腔狹窄的病理基礎。本研究實驗結果表明，利用這一原理構建小型豬髂總靜脈狹窄模型是切實可行的。

本實驗開始實施時，國內尚未有用于外周的DCB產品上市，而用于冠狀動脈的DCB直徑又不能滿足實驗需要。所以該實驗設計為：采用兩枚球囊分別封堵目標段靜脈近心端和遠心端后，再向封閉段靜脈管腔內注入紫杉醇與碘普羅胺混合液，以此延長活性藥物與管壁接觸時間來模擬DCB的作用。實驗結果證明，這樣的實驗設計，在操作上完全可行；在效果上達到了實驗預期，在2個月觀察期內有效地減輕了小型豬髂總靜脈狹窄程度；在安全性上，對小型豬肝、腎功能指標無明顯影響，且在整個實驗過程中未觀察到其他相關不良事件。

本實驗通過模擬DCB的作用，對小型豬髂總靜脈狹窄模型處理段管壁組織的病理轉歸過程產生了正面干預：與對照組相比，實驗組小型豬髂總靜脈管壁內VSMCs在紫杉醇的作用下增殖、遷移和分泌受到明顯抑制，減輕了靜脈內膜、中膜增生程度，從病理機制上降低了靜脈再狹窄的發生。

實驗中存在不足及有待改進之處：在臨床上，靜脈狹窄常見于：髂靜脈狹窄、鎖骨下靜脈狹窄、血液透析道狹窄、TIPS術后分流道狹窄、Budd-Chiari綜合征、器官移植后靜脈吻合口狹窄等。多數靜脈狹窄性病變的形成為慢性、漸進性過程，本實驗以急性機械損傷的方法建立小型豬髂總靜脈狹窄模型，與實際病變的發生、發展可能存在一定差別。在后續實驗改進中，通過適當的方法建立靜脈慢性狹窄的動物模型用于研究，可能更加貼近臨床實際。此外，本研究通過一定的實驗設計，利用“雙球囊封堵注藥法”來模擬DCB對靜脈管壁的作用，并不是直接使用DCB進行實驗。“雙球囊封堵”操作步驟繁瑣，小型豬頸靜脈穿刺困難，常需切開暴露穿刺，增加了手術時間及術后感染風險。目前用于外周的DCB產品已在國內上市，后續實驗中可直接使用DCB，以獲得更為準確的實驗數據。本實驗還存在樣本量較小、隨訪時間較短的不足。在后續的研究中，應增加樣本數量、延長隨訪時間，在靜脈狹窄的模型上進一步驗證DCB對靜脈狹窄性病變的有效性及安全性，使實驗結果更具說服力，對臨床治療有更高的指導價值。