紫外-可見分光光度法測定靈芝片中多糖、三萜及甾醇含量

姜 瑋 ，周桂生 ，陳驍鵬 ，葉 慧 ，喬 正 ，白鋼鋼 ，趙金龍 △

（1.江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046；3.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210046）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝 Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst. 或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實(shí)體，是傳統(tǒng)的大型藥用真菌，多糖、三萜及甾醇類化合物是其主要藥理活性成分[1-2]。多糖類化合物具有提高機(jī)體免疫力、耐缺氧能力等作用，三萜及甾醇類化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒(如艾滋病毒)等作用，因此，多糖類、三萜及甾醇類化合物的含量是判斷靈芝品質(zhì)的重要指標(biāo)[3-12]。為方便藥材調(diào)劑、制劑與有效成分的溶出，藥材市場上的靈芝以靈芝片（由靈芝切片而來）較多見，但2015年版《中國藥典(一部)》靈芝項(xiàng)下并未收錄靈芝片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[13]。因此，制訂以多糖類、三萜及甾醇類化合物含量測定為主的靈芝片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于規(guī)范中藥材市場的靈芝片及提高靈芝片質(zhì)量具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2700型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；Mettler XS105DU型電子天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水系統(tǒng)，SK8200GP型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；LR-16型高速冷凍離心機(jī)（北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

試劑：甲醇、硫酸、蒽酮、冰醋酸、香草醛、乙醇、高氯酸、乙酸乙酯均為分析純，試驗(yàn)用水皆為超純水；D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為 110833-201205，含量為99.5%），齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)為110709-200304，含量為100%），均由中國食品藥品檢定研究院提供。

顯色劑：稱取蒽酮0.2 g，精密稱定，加硫酸200 mL使溶解，搖勻（臨用新配），即得硫酸蒽酮溶液；稱取香草醛5 g，精密稱定，加冰醋酸溶解并定容至100 mL（臨用新配），即得香草醛冰醋酸溶液。5批靈芝片，均通過泰州市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室葉慧副主任中藥師鑒定，詳見表1。

表1 靈芝片來源及批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測定

2.1.1 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取 D-無水葡萄糖對(duì)照品13.07 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.130 0 mg/mL的溶液，即得。

供試品溶液：取本品粉末約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水60 mL，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，水浴蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75mL，搖勻，于4℃放置12 h，離心，棄上清液，沉淀物用熱水溶解，并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取上述溶液適量，離心，精密量取上清液3 mL，置25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 測定波長選擇

取 D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液，稀釋成質(zhì)量濃度為19.507 2 μg/mL的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法顯色后，于585～625 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)波長為625 nm時(shí)吸光度最佳，最終選擇波長625 nm作為測定波長。

2.1.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，分別置 10 mL 具塞試管中，加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光度，以D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.045X-0.026，R2=0.997(n=7)，質(zhì)量濃度線性范圍為 26.00 ～182.00 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液1.0 mL，置10 mL具塞試管中，依法測定吸光度，重復(fù)測定6次。結(jié)果的RSD為0.19%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液2.0 mL，按擬訂方法置10 mL具塞試管中，依法測定吸光度6次，間隔時(shí)間5 min。結(jié)果的 RSD為1.10%（n=6），表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品5份，按擬訂方法制備供試品溶液，精密吸取2.0 mL，置10 mL具塞試管中，依法測定吸光度值。結(jié)果平均含量為1.70%，RSD為1.60%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品5份，每份1.0 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液10.0 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，精密吸取2.0 mL，置10 mL具塞試管中，依法測定。結(jié)果見表2。

表2 多糖加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.1.4 樣品含量測定

同時(shí)測定5批供試品溶液，平行2次：精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計(jì)算，即得。結(jié)果見表3。

表3 不同廠家靈芝片中多糖、三萜及甾醇含量測定結(jié)果(%)

2.2 三萜及甾醇含量測定

2.2.1 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取齊墩果酸對(duì)照品9.95 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.199 0 g/L的溶液，即得。

供試品溶液：取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）45 min，濾過，濾液置 100 mL容量瓶中，加適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 測定波長選擇

取齊墩果酸對(duì)照品溶液，稀釋成質(zhì)量濃度為115.920 0 μg/mL的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法顯色后，于506～586nm波長范圍內(nèi)掃描，根據(jù)掃描結(jié)果，最終選取546nm作為測定波長。

2.2.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，分別置 15 mL 具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，于70℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑作空白，在546 nm波長處測定吸光度，以樣品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=0.051X-0.014，R2=0.999(n=5)，質(zhì)量濃度線性范圍為 19.00 ～99.50 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL，置15 mL具塞試管中，依法測定吸光度，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液0.2 mL，按擬訂方法置15 mL具塞試管中，依法測定6次，間隔時(shí)間 5 min。結(jié)果的 RSD為1.30%（n=6），表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品5份，按擬訂方法制備供試品溶液，精密吸取0.2 mL，置15 mL具塞試管中，依法測定吸光度值。結(jié)果平均含量為0.99%，RSD為1.00%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品5份，每份1.0 g，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液5.0 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，精密吸取0.2 mL，置15 mL具塞試管中，依法測定吸光度值。結(jié)果見表4。

表4 齊墩果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.2.4 樣品含量測定

同時(shí)測定5批供試品溶液，平行2次：精密量取供試品溶液0.2 mL，置15 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下方法，自“揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，計(jì)算，即得。結(jié)果見表3。

3 討論

紫外-可見分光光度法為常見定量方法[14]，因快速、簡單、性價(jià)比高，且具有一定的穩(wěn)定性和重復(fù)性，因此在中藥質(zhì)量分析中應(yīng)用較多[14]。雖有文獻(xiàn)表明，分光光度法與高效液相色譜（HPLC）法測定結(jié)果相差較大，分光光度法測定靈芝中總?cè)频暮坎荒苋鐚?shí)反映實(shí)際情況[15]，但三萜標(biāo)準(zhǔn)品的制備比較困難，至今還沒有出現(xiàn)定量所有三萜的文章；二是結(jié)合廠家實(shí)際檢測成本考慮，所以筆者參考2015年版《中國藥典(一部)》靈芝的含量測定方法，采用紫外-可見分光光度法對(duì)5批靈芝片的多糖、三萜及甾醇進(jìn)行含量測定。

5批靈芝片多糖測定結(jié)果均符合2015年版《中國藥典(一部)》靈芝項(xiàng)下規(guī)定（應(yīng)不小于0.90%），最高1.70%，最低0.94%，平均1.38%，取平均值的70%并結(jié)合2015年版《中國藥典(一部)》制訂靈芝片多糖含量限度，則靈芝片多糖含量以無水葡萄糖（C6H12O6）計(jì)，不得少于0.90%；三萜及甾醇測定結(jié)果同樣符合2015年版《中國藥典(一部)》靈芝項(xiàng)下規(guī)定（應(yīng)不小于0.50%），最高0.99%，最低0.58%，平均0.73%。取平均值的70%并結(jié)合2015年版《中國藥典》，制訂靈芝片三萜及甾醇含量限度，則靈芝片三萜及甾醇含量以齊墩果酸（C30H48O3）計(jì)，不得少于 0.50%。

此外，本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，多糖、三萜及甾醇含量最高與最低相差近1倍，可能是不同種屬、不同采收季節(jié)所致[16]；多糖含量高的樣品，三萜及甾醇含量也相對(duì)較高，反之亦然。

綜上所述，本研究中采用紫外-可見分光光度法對(duì)5批靈芝片進(jìn)行多糖、三萜及甾醇的含量測定，方法可行、可靠、準(zhǔn)確。