單步硝化作用與全程氨氧化微生物研究進展

石秀麗，郭萌萌，張瑩，秦華，萬琪慧，謝德體，蔣先軍*

(1.西南大學園藝園林學院，重慶 400715；2.西南大學土壤生物研究中心，重慶 400715；3.西南大學農業研究院，重慶 400715；4.西南大學資源環境學院，重慶 400715)

硝化作用是自然界中連接氧化態無機氮和還原態無機氮的唯一過程，將自然界氮素的最低價態(NH3)轉化為最高價態(NO3-)，完成了氮素的整個氧化還原循環過程，在維持全球氮素平衡中起著關鍵作用。硝化作用的最終產物—硝態氮，是植物生長的重要氮源[1]。數十年來人們一直認為硝化作用過程由兩個步驟完成：首先由氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)[2]和/或氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archeae, AOA)[3]先將氨氧化成亞硝酸鹽，然后再由亞硝酸鹽氧化細菌(nitrite-oxidizing bacteria, NOB)[2]將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。最近的研究發現屬于亞硝酸鹽氧化細菌的亞硝化螺菌屬(Nitrospira)中的部分種群可以單獨完成將氨氧化為硝酸鹽，該過程被稱為“單步硝化作用”(one-step nitrification)[4-5]，而這些微生物則被定義為全程氨氧化微生物(complete ammonia oxidizers, comammox)。只能夠將氨氧化為亞硝酸鹽的AOA、AOB以及只能氧化亞硝酸鹽的NOB則可被稱為“半程氨氧化微生物”(incomplete ammonia oxidizers)[4-5]。

單步硝化作用與全程氨氧化微生物的發現引出了大量與硝化作用研究相關的亟待解決的科學問題。首先，由于氨被完全氧化成硝酸鹽可以釋放出更高的能量，那么在什么情況下comammox對硝化作用的貢獻會超過別的硝化微生物？以前對comammox的忽視是否過高估計了“標準”硝化微生物的活動？此外，尤為重要的是要了解全程氨氧化微生物(comammox)與“半程氨氧化微生物”AOA和AOB以及NOB的生態位劃分，這對了解環境中的硝化作用具有重大意義。基于此，本研究對全程氨氧化細菌發現以來的研究進展做了回顧，并對該領域今后的研究方向進行展望。

1 概述

目前已確定的全程氨氧化微生物，包括可培養的和不可培養的，均屬于硝化螺菌屬(Nitrospiraspp.)。硝化螺菌(Nitrospiraspp.)被認為是嚴格的亞硝酸鹽氧化細菌，廣泛分布于農業土壤、森林土壤、稻田水域、淡水環境，如濕地、河床、含水層和湖泊沉積物，以及工程系統(活性污泥和飲用水處理廠)中[5-7]。硝化螺菌具有豐富的多樣性，至少包含6個經常共存的屬，到目前為止已發現的comammoxNitrospira基因組屬于硝化螺菌譜系Ⅱ(Nitrospiraspp. Linage Ⅱ)。根據全程氨氧化微生物的氨單加氧酶(ammonium monooxygenase, AMO)的系統發育，comammoxNitrospira譜系Ⅱ，包括兩個分支A和B(Clade A和Clade B)。已經分離培養的有3個種，包括Ca.Nitrospira nitrificans,Ca.Nitrospira nitrosa,Ca.Nirospira inopinata (1，2)；從全球基因庫獲得amoA序列分析，如圖1所示：全程氨氧化微生物分支A有31個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，分支B有19個OTU[8]。comammoxNitrospira的兩個分支以及其他常規的Nitrospira都可以在環境中與AOB、AOA以及NOB共存。

圖1 基于氨單加氧酶基因amoA的全程氨氧化微生物的系統發育樹[8]Fig.1 Phylogenetic affiliation tree of comammox amoA genes[8] DWTP Friedrichshof, Germany 德國，弗里德里希豪夫，飲用水處理廠；Rice paddy soil, Vercelli, Italy 意大利，維切利，水稻土；Recirculating aquaculture system biofilter, Radboud University, Netherlands荷蘭，拉德堡德大學，再循環水產養殖系統生物過濾器；Beech forest top soil, Klausen-Leopoldsdorf, Austria 奧地利，克勞森-利奧波茨多夫，山毛櫸森林表土層；GWW Wolfenbüttel Germany 德國，沃爾芬比特爾，地下水井；DWTP Breehei, Limburg, Netherlands 荷蘭，林堡，布里黑，飲用水處理廠；Vialone Nano rice rhizosphere, Vercelli, Italy 意大利，維切利，意大利維阿龍圓米根際；WWTP Lieshout, Lieshout, Netherlands 荷蘭，利斯豪特，大型污水處理廠；Lake Herrensee, Seewinkel, Austria 奧地利，塞溫克爾，郝倫湖；WWTP Vetmed, Vienna, Austria 奧德利，維也納，維特梅，大型污水處理廠；WWTP Ingolstadt, Ingolstadt, Germany 德國，英格爾斯塔特，大型污水處理廠；Enrichment culture clone from Schwarzer River, Austria 奧地利，施瓦澤河，富集培養克隆。

2 全程氨氧化微生物對氨具有更高的親和力

自然環境中，硝化反應的底物-氨分子主要來源于有機氮的分解過程。而在大多數環境里，氨分子濃度極低，因此對氨的競爭是氨氧化微生物(包括comammox, AOA和AOB)復雜的群落演化的一個主要因素[9]。以前的研究結果均認為氨氧化古菌(AOA)對氨的親和力遠遠超過氨氧化細菌(AOB)，從而在氨濃度很低(亞微摩爾濃度)的環境中對氨的競爭勝過氨氧化細菌(AOB)。例如，生活在海洋中的AOA通過調整細胞機制(包括關鍵的氨氧化酶-氨單加氧酶)依賴極低的底物濃度(小于10 nmol·L-1)進行生長[10]。據此人們認為陸地生態系統中的AOA，就像它們的海洋親系一樣，對氨具有很高的親和力，所以可能在低氨濃度下比對氨氧化細菌更具有競爭力。但是由于可培養的AOA并不多，對AOA氨親和力的測定數據非常少(表1)，該結論的普遍性尚需進一步證明。最近Kits等[11]的研究發現，全程氨氧化細菌Nitrospirainopinata比大多數可培養的AOA物種對氨具有更高的親和力，能夠更好地適應極低氨濃度的環境(表1)。

表1 全程氨氧化細菌, AOA和AOB對NH3的親和力Table 1 The affinity of comammox, AOA and AOB to NH3

a: 此表中NH3濃度理論上是基于這個平衡(NH3+H+?NH4+, pKa=9.25)在25 ℃。NH3concentrations in this table are theoretically predicted based on the equilibrium (NH3+H+?NH4+, pKa=9.25) at 25 ℃.

全程氨氧化細菌Nitrospirainopinata比大多數可培養的AOA物種對氨具有更高的親和力的研究結果改變了我們對全程氨氧化微生物的認識。事實證明，它們不是棲息在邊緣地帶的稀有微生物，而是廣泛分布在氨貧瘠的環境中，即地球生物圈的大多數環境中。全程氨氧化細菌具有更高的氨親和力和生產量可以解釋為什么它們能夠單獨完成硝化作用的兩個步驟：氨氧化與亞硝酸鹽氧化。comammoxNitrospira物種更多地分布在氨缺乏的地下水、飲用水處理系統和一些土壤中。然而，在其他氨貧乏的環境中，如森林、土壤和海洋，卻是由AOA和AOB主導氨氧化作用[10,21]。如果全程氨氧化細菌比AOA和AOB對氨的親和力更高，為什么會出現這種情況呢？可能的原因是這些環境中氨氧化微生物絕大多數是目前不可培養的，而它們對氨的親和力和生長率實際上高于它們的可培養的親緣物種(表1)。另一種可能是除氨親和力和生產量以外的更重要的因素決定了氨氧化群落的形成和組成。

雖然comammoxNitrospirainopinata與只能氧化亞硝酸鹽的Nitrospira物種(傳統意義上的NOB)密切相關，但是研究人員發現它對亞硝酸鹽的親和力很差(約500 μmol·L-1)[11]。這種差的親和力可能阻止其在大多數亞硝酸鹽濃度較低的環境中作為純亞硝酸鹽氧化細菌生長。當comammoxNitrospirainopinata生長在適合其作為氨氧化微生物的環境中時，亞硝酸鹽可以在細胞內累積。因為不需要從外界環境中同化亞硝酸鹽，從而克服了對亞硝酸鹽的親和力差這種明顯的缺陷。

3 全程氨氧化微生物具有不同的氮代謝途徑

迄今為止所有已發現的全程氨氧化微生物都屬于硝化螺菌譜系Ⅱ(Nitrospiraspp. Linage Ⅱ)，基因組都同時編碼了氨單加氧酶(ammonium monooxygenase, AMO)、羥胺氧化還原酶(hydroxylamine dehydrogenase, HAO)和亞硝酸氧化還原酶(nitrite oxidoreductase, NXR)的基因[5-6]。β-AOB具有2～3份AMO和HAO基因簇的拷貝，而全程氨氧化細菌comammoxNitrospira通常只有AMO和HAO基因的一份單拷貝，與γ-AOB, AOA相同[22]。同時，大多數全程氨氧化細菌還具有NXR的單份拷貝，而有的全程氨氧化細菌(Nitrospiramoscounksis)可以擁有5份NXR的拷貝。

在氮素吸收方面，全程氨氧化細菌分支A(comammoxNitrospiraclade A)具有與β-AOB同源相似性的低親和力RH型氨轉運蛋白序列；而另外一個分支B(comammoxNitrospiraclade B)則與典型的硝化螺菌相似，具有高親和性Amtb型氨轉運蛋白序列[22]。因此，全程氨氧化細菌不同分支(clade A, clade B)之間對氨吸收親和力的區別可能是一個重要的生態位分化因子。此外，大多數全程氨氧化細菌基因組中含有脲酶基因，因此可以通過尿素降解獲得氨，這與部分AOA和AOB相似。全程氨氧化細菌還具有多個不同的尿素轉運體，除了高親和力的尿素ABC轉運體[1]，還有兩個額外的尿素轉運體：一個外膜孔蛋白(fmdC)，參與極低濃度[23]對短鏈酰胺和尿素的吸收，另一個是尿素羧化轉運體(uctT)。此外，comammox基因組獨特地含有一個額外的胍丁胺酶基因，可以水解胍丁胺，產生腐胺和尿素，是全程氨氧化細菌與典型的硝化螺菌(Nitrospiraspp.)系統區分的一個代表性特征[22]。

尤為重要的是，全程氨氧化細菌基因組缺乏一種同化亞硝酸還原酶(nirA)或octaheme細胞色素C(octaheme cytochrome C, OCC)的基因[1]。所以在亞硝酸鹽作為唯一N源存在時，全程氨氧化細菌將無法生長。

4 全程氨氧化微生物與氨氧化微生物及傳統硝化細菌的生態位分化

對于兩個comammoxNitrospira分支功能的差別以及comammoxNitrospira和AOA、AOB之間的生態位分化還知之甚少，目前只有一個假說，也就是在表面被附著、底物受限的環境中，comammoxNitrospira比典型的AOB對氨具有更強的競爭力[4]。

Palomo等[22]發現β-AOB具有2～3份amo和hao基因簇的拷貝，以及NOX排毒途徑的基因。這些特性為β-AOB在氨充足的環境中主導氨氧化過程提供了基礎。相比之下，comammoxNitrospira通常只有amo和hao基因的一份單拷貝，與γ-AOB, AOA相同；此外，與AOA相同，comammoxNitrospira缺乏膜結合細胞色素c-氧化氮還原酶(cNOR)，血紅素-銅一氧化氮還原酶(sNOR)、亞硝酸鈉和細胞色素P460(cytL基因)；而在β-AOB中，所有這些基因都存在[22]。綜合來看，comammoxNitrospira更能夠適應低氨濃度環境，因此可以更直接地與其他氨氧化微生物競爭氨，尤其在氨濃度很低的環境里。

一些硝化螺菌可以利用亞硝酸鹽以外的底物作為電子供體，例如甲酸和氫[1,24-25]。編碼甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase, FDH)的基因只出現在典型的硝化螺菌和全程氨氧化細菌分支B(comammoxNitrospiraclade B)中，而在全程氨氧化細菌分支A中則沒有發現。另外一個方面，編碼甲酸氫化酶[FHL(formate hydrogenlyase), 產生氫氣的酶]的基因，只在典型的硝化螺菌基因組和3個全程氨氧化細菌分支A(A2_bin,AAU_MBR_1和Ca.N.nitrosa)的基因組中發現[22,24]。由于甲酸普遍出現在有氧-缺氧過渡區，因此，這為 comammox分支A、B與典型的硝化螺菌的生態位分化提供了一個基礎。

不同的氨氧化微生物群體在碳固定途徑上也具有明顯的不同。AOB和AOA分別利用耐氧的卡爾文循環(Calvin-Benson-Bassham)和羥基丙酸-羥基丁酸循環，而全程氨氧化細菌則利用微量需氧的還原性三羧酸循環 (rTCA)。此外，典型的氨氧化細菌基因組編碼低親和性的aa3型血紅素-銅氧化酶；與之相比，全程氨氧化細菌則具有很高的親和力的細胞色素-類bd氧化酶類[22]。與β-AOB不同的是，comammoxNitrospira基因組有兩種主要的氨氧化路徑的單拷貝基因，缺失涉及NO還原的基因，能編碼允許在低濃度氧氣下高效生長的基因，因此，comammoxNitrospira比β-AOB更習慣于貧營養的低氧環境條件[22]。此外，全程氨氧化細菌還具有與氧化應激抵抗和氧清除相關的2/2血紅蛋白II(TrHb2)基因序列[26-27]，而AOB和AOA的基因組中則沒有。這些特征表明，comammoxNitrospira更能夠適應微量氧濃度的環境，在氧濃度不足的環境中對AOB和AOA具有競爭優勢。

全程氨氧化細菌的另一個特性是，基因組含有堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, phoD)，在磷不足和饑餓下可以高度表達[28-29]；而在AOA基因組中沒有檢測到堿性磷酸酶，在AOB中也不是普遍存在的(有同源基因位于Nitrosomonassp. Is79A3、亞硝化球菌和亞硝化螺菌屬中)[22]。意味著全程氨氧化細菌在磷和銅貧瘠的條件下相比其他氨氧化微生物更具有競爭優勢。

綜上所述，全程氨氧化細菌具有這樣的特性，是一種適應貧營養條件的生長緩慢的微生物。到目前為止，全程氨氧化細菌(comammoxNitrospira)主要分布在底物有限的環境中，以及在低氧環境和/或微量氧氣小生境中[5-6,8,30-32](圖2)。

圖2 全程氨氧化微生物與半程氨氧化微生物在環境中的生態位分化示意圖 Fig.2 The niche specialization and differentiation of comammox organisms with incomplete ammonia-oxidizing microorganisms 氨分子濃度單位為nmol·L-1。The unit for ammonia concentration is nmol·L-1.

5 全程氨氧化微生物帶來的科學問題及今后的研究方向

到目前為止，只有少數生態系統已經篩查出全程氨氧化細菌(comammoxNitrospira)的豐度，表明這些微生物在低氨環境中可能較為普遍。現在需要確定的是它們在不同生態系統中對硝化作用的貢獻。全程氨氧化細菌在一些氨匱乏環境中的分布不僅可能是因為它們對氨的高親和力，還可能由其他因素，諸如它們在氨以外的基質上生長的能力和它們的低能量需求等。這些因素可能在氨氧化微生物群落結構的形成與進化中具有綜合作用，需要更深入地了解AOA、AOB和comammox的生理機能，并對生態和這些微生物進化作更深刻的認識。包括：1)是否還有更多尚未被發現的comammox? 2)全程氨氧化細菌比AOA和AOB對氨的親和力更高，具有更高效的能量利用方式，是否能夠或者在什么環境中在硝化過程中起主導作用？3)在不施肥的自然生態系統中，氨濃度極低，但為什么氨氧化微生物豐度卻非常高？還有其他的科學問題，如全程氨氧化過程是否產生溫室氣體N2O等等。

因此，未來的研究首先是要全面了解comammox在不同生態系統中的分布。需要在區域以及全球尺度了解comammox, AOA, AOB及標準硝酸鹽氧化細菌(NOB)在森林生態系統、濕地-沼澤生態系統以及農田生態系統中的分布數據，并結合生物信息數據，如宏基因組、宏轉錄組、宏代謝組等數據，分析comammox, AOA, AOB及標準硝酸鹽氧化細菌(NOB)的生態位分化規律。研究其他生物與非生物因子(尤其是pH, Eh)對上述硝化微生物生態位分化的影響。其次，結合全基因組測序改進培養方法，獲得更多可培養的comammox，以研究comammox的生理特性及功能。現有的可培養的comammox均來自水生生態系統，無法了解土壤中的comammox是否與水生生態系統中的comammox具有相似的特點，也無法判斷土壤中全程氨氧化微生物對硝化作用的相對貢獻。雖然許多土壤微生物仍然被認為是不能培養或不可培養的，但是在過去的很多年里，許多微生物分離和培養方法有了很大的突破，氮循環中微生物的真正作用有可能通過培養的方法和分子生態技術的結合來闡明。