種質及變溫對羊草種子萌發的影響

楊偉光，劉盼盼，袁光孝，毛培勝，齊冬梅，董曉兵，劉輝，李曉霞*，劉公社*

(1.中國科學院植物研究所，北京 100093；2.中國科學院大學，北京 100049；3.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005；4.中國農業大學草業科學系，北京 100193)

種子是裸子植物和被子植物特有的繁殖體，大多數有花植物通過有性生殖和產生種子繁衍后代，種子的活力和成功萌發、成苗決定著植物種群的繁衍和生存，直接影響作物的產量。

羊草(Leymuschinensis)是我國重要的多年生禾本科牧草資源，由于其野生性較強，種子存在著發芽率偏低的現象[1]，嚴重影響了羊草的生產應用。目前關于羊草萌發率低的主要原因無統一的定論，有抑制物引起的生理性休眠[2]，有因種子本身基因型或收獲地的土壤及氣候類型[3]、發芽溫度、物理阻礙和胚乳阻礙[4-7]等說法阻礙萌發。研究表明，除熱水浸種不利于羊草種子萌發外，其余方法如濃硫酸處理、冷層積處理、PEG處理、硝酸鉀溶液處理以及清水浸種等方法都能在一定程度上破除羊草種子休眠，提高發芽率[8-13]。另外，普遍研究認為變溫能夠促進羊草種子萌發，而恒溫則不利于其萌發。但以上這些研究尚無系統性的結論，主要原因是材料有限，均以1份或幾份羊草材料進行研究，并未開展不同基因型之間的比較研究。雖然變溫促進羊草種子萌發已證實，但變溫處理的窗口期及處理最短時長還不清楚。因此，需要對這些問題開展系統和深入的研究，進一步揭示羊草種子萌發的規律，為生產實踐提供理論基礎。

本研究主要以43份羊草種質為材料，對其萌發規律進行研究，包括羊草不同基因型間種子萌發差異、羊草種子萌發的最優條件、變溫對種子萌發的影響等，旨在闡明不同基因型羊草種子萌發的規律、初步探究變溫調控羊草種子的萌發規律，為羊草種子萌發研究提供基礎理論數據，同時對羊草新品種選育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所有羊草種質材料均來源于中國科學院植物研究所種質資源圃，共43份，收獲地點為北京植物園，東經116°12′，北緯39°59′，海拔 61.6 m，年均溫度12.8 ℃，年降水量 532.6 mm，≥0 ℃積溫4400 ℃，無霜期 190～195 d，極端最低溫度-13.8 ℃，極端最高溫度 38 ℃，土壤為棕壤土。收獲年份在2014-2015年，具體見表1。其中溫室內測試出苗率所用材料為41份，光照培養箱內測試萌發率的材料為35份，用于變溫測試萌發率的材料總計為4份。

1.2 實驗設計與方法

1.2.1溫室內營養缽出苗率測定 取直徑11 cm裝有混合營養土(營養土∶蛭石=1∶1)的營養缽，用平皿輕輕壓平土表，將營養缽放到盛水的托盤內吸水過夜。取出50粒人工挑選的種子均勻地撒在土表，4次重復。用混合營養土均勻地撒在土表，形成0.5～1.0 cm的覆蓋層，并用平皿輕輕按壓覆蓋層，用噴霧壺噴濕土表。將托盤放到溫室內(自然光照，相對濕度35%～45%，溫度16～38 ℃)，計算20 d內出苗率，出苗標準為胚芽鞘伸出土表1 mm。

1.2.2光照培養箱萌發率測定 取鋪有浸濕濾紙的玻璃平皿，將30粒人工挑選的種子均勻地排列在濾紙上，4次重復。將皿蓋傾斜45°蓋到平皿上，平皿和皿蓋一起放入托盤內，托盤內倒入1 cm深的蒸餾水。將托盤放到光照培養箱{光照強度40 lx，相對濕度35%，溫度28 ℃[12 h晝(day, D)]/16 ℃[12 h夜(night, N)}中，計算20 d內的萌發率，萌發標準為胚根伸出1 mm。

1.2.3不同溫度處理種子萌發 1)變溫與恒溫處理：變溫處理為28 ℃(12 h晝)/16 ℃(12 h夜)，恒溫處理分別設16、20、22、28和37 ℃，光照培養箱測定萌發率。

2)變溫時長處理：在羊草種子萌發的前6 d，設18個不同時長變溫(change temperature，CT)處理，從變溫處理6 d逐步縮小到1 h，見表2。變溫處理后將種子取出立即放入恒溫28 ℃光照培養箱內萌發，對照組為一直恒溫(steady temperature，ST)和變溫萌發，4次重復。

表1 試驗材料來源與編號Table 1 Origin and codes of experimental

表2 變溫時長處理Table 2 The treatments of changing temperature for different times

CT:變溫Change temperature；ST:恒溫Steady temperature.下同The same below.

3)變溫時段處理：在萌發的前6 d，設14個處理(表3)，分別于不同萌發時段進行28 ℃/16 ℃變溫處理，其他時段均置于恒溫28 ℃光照培養箱內萌發，對照組為一直恒溫萌發，4次重復。

表3 變溫時段處理Table 3 The treatments of changing temperature at different times

1.3 數據處理

統計分析采用SPSS 17.0和Microsoft Excel軟件完成，使用Microsoft Excel和Origin 8.0軟件作圖。采用單因素方差分析和LSD最小顯著差異法檢驗不同基因型和不同變溫時長、時段處理的羊草種子萌發率的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同種質對羊草種子出苗率的影響

通過對41份不同基因型的種子在溫室內的出苗率進行測定，結果表明不同種質間出苗率差異較大，出苗率從10.00%到61.33%，出苗率集中分布在20%～30%(圖1)，占所有出苗種質材料的46.34%，表明羊草種子出苗率受種質影響較大。

此外，通過光照培養箱對35份羊草材料種子萌發率進行測定，結果顯示不同材料種子萌發率差異也較大，從36.67%到95.00%，主要集中在60%～100%，占所有萌發種質材料的85.71%(圖2)，進一步說明羊草種子的萌發率高低與種質相關。

圖1 41份羊草種質材料出苗率分布Fig.1 Distribution histogram of seed emergence rate of 41 different germplasms

圖2 35份羊草種質材料種子萌發率分布Fig.2 Distribution histogram of seed germination rate of 35 different germplasms

2.2 不同溫度條件下羊草種子萌發率的變化

圖3 不同溫度條件下3種羊草種子的萌發率 Fig.3 The seed germination rate of 3 type L. chinensis under different constant temperature and 28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h) variable temperature 圖中的數據為平均值±標準誤，不同大寫字母或小寫字母代表材料間或處理間在 P<0.01或P<0.05水平上差異顯著，下同。The data in the picture are the mean±SE.The different capital or small letters indicate significant difference at the 0.01 or 0.05 level within materials or treatments.The same below.

2.2.1恒溫、變溫條件下羊草種子萌發規律 選取的XQ10-1、D23、SF2-1這3種羊草種質材料，恒溫處理下(16、20、22、28、37 ℃)3種材料種子萌發率均低(<20%)，甚至萌發率為零(圖3)，同一種質材料的羊草種子各恒溫間的萌發率差異不顯著。而變溫28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h)，3種羊草種子萌發率顯著增加，增幅50%～90%，且種質間的種子萌發率也不同，XQ10-1、D23、SF2-1分別為52.50%、77.78%和90.83%，表明變溫可以顯著提高羊草種子萌發率。

2.2.2不同時長的變溫處理下羊草種子萌發規律 選取4種羊草種質材料(D50，XQ10-1，2015年收獲的SF2-1和149)，進行6 d內不同時長變溫處理后再放到28 ℃恒溫條件下進行萌發，發現4種羊草種子所有的不同時長變溫處理的萌發率均極顯著(P<0.01)高于恒溫對照，且種子的萌發率在變溫處理1～5 d，隨著變溫時間的增加，萌發率有顯著提高(圖4)。除材料D50外，其余3種材料在變溫時長≥4 d的羊草種子萌發率與變溫對照相比差異不顯著，表明變溫處理3～4 d后羊草種子萌發率達到萌發最高值。

圖4 4種羊草種質材料的種子萌發率對不同時長變溫處理的響應Fig.4 The seed germination rate of 4 different L. chinensis under 28 ℃ constant temperature and 28 ℃(12 h)/16 ℃(12 h) variable temperature for various days

此外，與恒溫萌發對照相比，變溫處理1和2 d，種子萌發率極顯著提高(P<0.01)。變溫處理2與1 d相比，種子萌發率有顯著提高；而處理3 d以上與前一天相比，除SF2-1之外，其余種質材料的種子萌發率均無顯著差異。因此，與恒溫對照相比，變溫處理1～2 d即可顯著提高羊草種子萌發率。

上述結果表明，變溫處理1 d，羊草種子萌發率就有極顯著提高(P<0.01)。為了進一步探究1 d內，即24 h內變溫時長對羊草種子萌發影響的窗口期，以SF2-1為試驗材料，對萌發第1天以4 h為一個梯度進行變溫處理，結果表明6個不同梯度處理中，羊草種子萌發率均較恒溫有極顯著提高(P<0.01)，而且變溫時間越長萌發率提高越大，當變溫時長大于16 h后，萌發率不隨時間變長而繼續提高(圖5)，其中變溫8 h即可顯著提高羊草種子的萌發率(P<0.01)。

進一步對萌發第8～12 h的1 h梯度變溫處理實驗表明，當變溫處理1 h，雖然羊草種子萌發率有提高，但與恒溫對照相比差異不顯著(P>0.05)。當變溫時長為2 h以上時，羊草種子萌發率較恒溫對照顯著提高(P<0.05)，變溫時長為4 h時，萌發率極顯著(P<0.05)提高，說明變溫處理2 h為羊草種子萌發率提高的窗口期，見圖6。

圖5 4 h梯度不同時長變溫處理對羊草種子萌發的影響Fig.5 Germination rate in different duration of variable temperature under 4 h interval

圖6 1 h梯度不同時長變溫處理對羊草種子萌發的影響Fig.6 Germination rate in different duration of variable temperature under 1 h interval

1:恒溫對照Steady temperature (CK);2:變溫4 h Change temperature for 4 h;3:變溫8 h Change temperature for 8 h;4:變溫12 h Change temperature for 12 h;5:變溫16 h Change temperature for 16 h;6:變溫20 h Change temperature for 20 h;7:變溫24 h Change temperature for 24 h.

1:恒溫對照Steady temperature (CK);2:變溫1 h Change temperature for 1 h;3:變溫2 h Change temperature for 2 h;4:變溫3 h Change temperature for 3 h;5:變溫4 h Change temperature for 4 h.

2.2.3不同時段變溫處理對羊草種子萌發率的影響 為了探尋28 ℃/16 ℃變溫處理對種子萌發作用的具體時間段，選取4種不同基因型的種子進行了6 d內不同時段的變溫處理，即分別在第1天，第2天，依次到第6天進行變溫處理，結果表明,與恒溫對照相比，第1天變溫處理，即可極顯著地提高種子的萌發率(P<0.01)；隨著變溫處理時間段的延后，種子萌發率的增長越少。與變溫對照相比，羊草種子萌發期間，越早對其進行變溫處理，種子最終萌發率提高得越多，而較晚進行變溫處理，例如第6天進行變溫處理，萌發率提高不明顯(P>0.05)，見圖7。

圖7 4種基因型羊草種子的萌發率對不同時段變溫處理的響應Fig.7 The germination rate of 4 genotype seeds in 28 ℃ constant temperature and 28 ℃(12 h)/16 ℃(12 h) variable temperature at different days

在6 d內不同變溫時段變溫處理的研究中，發現萌發第1 天進行變溫，萌發率極顯著提高。為了進一步探究變溫處理的敏感期，選取SF2-1為試驗材料，將萌發第1天分成6個4 h的時段進行變溫處理，結果表明,與恒溫對照相比，各時段變溫處理的羊草種子萌發率均有極顯著(P<0.01)提高，而且不同時段變溫處理對萌發率提高幅度有差異，萌發開始的第8～12 h變溫處理，萌發率提高最多，即此時是變溫處理最敏感時期，見圖8。

3 討論與結論

圖8 羊草種子在萌發第1天不同時段對變溫處理的響應 Fig.8 The germination of seeds in 28 ℃ constant temperature and 28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h) changing temperature at different time period in first day 1:恒溫對照Steady temperature (CK);2:0～4 h變溫Change temperature on 0-4 h;3:4～8 h變溫Change temperature on 4-8 h;4:8～12 h變溫Change temperature on 8-12 h;5:12～16 h變溫Change temperature on 12-16 h;6:16～20 h變溫Change temperature on 16-20 h;7:20～24 h變溫Change temperature on 20-24 h.

3.1 討論

前期研究發現，羊草發芽率低的主要原因是其有較強及較長的種子休眠期[2]，且羊草種子萌發率的高低不僅與種子休眠程度有關，還與發芽溫度[14]、種子活性[15]、激素種類與含量水平[8]、氣候條件、土壤類型等有關[10]。且通過濃硫酸處理、冷層積處理、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)處理、硝酸鉀溶液處理以及清水浸種等方法均能在一定程度上提高羊草種子發芽率[6,16]。加入氟啶酮進行羊草種子冷層積，可完全破除羊草種子休眠，使種子萌發率達到96%[17]；用30%聚乙二醇處理羊草種子24 h后，能顯著提高羊草種子發芽率和幼苗活力[10]；也有研究發現清水浸種1 d后用 30% NaOH處理60 min, 施加200 g·g-1GA3，可使羊草種子發芽率達到91%[8]。 以上這些研究為羊草生產實踐提供了依據，但是這些均屬于外界環境因素對種子萌發的影響，而本研究中對43份羊草種質在溫室條件及光照培養箱中的萌發率進行測定，發現不同羊草種質材料的種子萌發率差異顯著，說明羊草種子的萌發率與種質密切相關，這一結論為今后選育具有高萌發率的羊草種質及培育羊草新品種奠定了基礎，也為下一步從分子生物學方面探究不同種質羊草種子萌發差異的分子機理奠定了理論基礎。

種子萌發是一個生理生化變化的過程，是在一系列酶的參與下進行的，而酶的催化與溫度有密切的關系。前人研究發現，恒溫不利于羊草種子發芽，低溫和變溫都能顯著地提高種子萌發率[2,6,14,18-20]。何學青等[8]表示20 ℃(12 h)/30 ℃(12 h)可以最大限度地提高羊草種子的萌發率；藺吉祥等[21]在20 ℃(12 h)/30 ℃(12 h)萌發條件下，通過對發芽率、發芽速率、開始發芽時間以及50%種子發芽天數等指標進行觀察，發現變溫處理可以顯著提高羊草種子的萌發率。本研究發現恒溫(16、20、22、28、37 ℃)條件下，3種基因型種子萌發率均低(<20%)，甚至萌發率為零，而變溫28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h)，3種羊草材料種子萌發率顯著增加，增幅50%～90%，這一結論與前人研究結果相類似[18]，但是不同種質材料的種子對變溫的響應是不同的，例如本研究中選用的XQ10-1、D23、SF2-1這3種材料，在28 ℃ (12 h)/16 ℃ (12 h)變溫條件下的萌發率分別為52.50%、77.78%和90.83%，且三者之間差異極顯著(P<0.01)。溫度影響種子萌發的主要原因可能是溫度影響膜透性、膜結合蛋白的活力以及種子內赤霉素GA3、細胞分裂素和 ABA的合成代謝等[22]，而在羊草中溫度影響種子萌發的機理有待深入研究。

變溫能夠促進羊草種子萌發已被廣泛研究證實，但是變溫處理的窗口期及處理最短時長目前還尚不清楚。本研究通過進一步細化1 d內的變溫處理效應，發現只要變溫處理時長大于2 h時，萌發率有顯著提高，且時長越長，萌發率增加幅度越大，但當時長達到16 h后，萌發率不再隨時長而提高，說明2～16 h變溫處理導致的萌發率提高有一種累加效應。此外，不同時間段處理，導致萌發率提高幅度不同，前12 h內，處理時間越往后，萌發率提高幅度越大，8～12 h處理，產生了最大萌發率，說明變溫影響種子萌發的敏感期在種子萌發開始的8～12 h。在羊草種子萌發試驗中，得知吸脹過程大約在種子加水后6 h結束，而低溫是誘導種子萌發的敏感期,在8～12 h，這可能就是導致不同時段變溫處理萌發率不同的原因。而本實驗中變溫時長越長，萌發率越高，即變溫的疊加效應，可能與低溫層積的原理相似[23]。因此，通過本研究確定羊草種子萌發響應變溫的敏感期及關鍵時間點后，可采用現代生物學技術方法(新一代測序技術等)闡明恒溫抑制及變溫誘導羊草種子萌發的分子機理，為進一步解析羊草種子萌發的分子調控機制提供理論依據。

3.2 結論

羊草種子萌發率不僅與羊草種質有關，而且受萌發溫度影響較大。41份不同羊草種質材料的種子間溫室內出苗率差異較大，出苗率從10.00%到61.33%，出苗率集中分布在20%～30%，另外其中的35份羊草種子材料在光照培養箱中萌發率差異也較大，從36.67%到95.00%，主要集中在60%～100%。恒溫條件下種子萌發率均較低，而變溫28 ℃/16 ℃可顯著提高種子萌發率，增幅50%～90%。 且變溫處理對種子萌發有時間劑量累加效應，即變溫處理時間越長，萌發率提高越大。變溫處理在第1天的效應最大，1 d內影響種子萌發的時長在2～16 h，高于16 h萌發率不隨時間增加，低于2 h萌發率提高不顯著；此外還發現，萌發24 h之內，羊草種子對變溫處理有一個敏感的窗口期，即8～12 h，在這個時段內變溫處理對種子萌發率提高最為顯著。