我國水稻紋枯病菌的融合類群及致病性差異

王愛軍，王娜，顧思思，趙文娟，李平，鄭愛萍*

(1.四川農業大學水稻研究所，四川 溫江 611130；2.四川農業大學西南作物基因資源與遺傳改良教育部重點實驗室,四川 雅安 625014；3.四川農業大學風景園林學院，四川 溫江 611130)

水稻(Oryzasativa)是我國重要的糧食作物之一，有65%的人口以稻米為主食，在糧食生產中具有十分重要的地位[1]。水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的一種世界性水稻病害[2]，該菌可形成抗逆性強的菌核結構，在土壤中存活時間較長，發病時還可通過植物葉片橫向傳播，是一種具有土傳和葉傳雙重特性的半腐生真菌，可侵染多種寄主，一般在水稻分蘗期高溫、高濕條件下發生侵染[3-5]。近年來，隨著水稻高產、多蘗、粗稈大穗型栽培種的推廣，過量施用氮肥以及種植密度的加大，使田間通風差、濕度大，為紋枯病菌侵染提供了有利的環境條件[6-7]。由水稻紋枯病菌侵染造成的病害損失達10%～50%[8-9]，且有逐年加重的趨勢，已發展成為制約我國水稻高產的主要病害，嚴重威脅我國的水稻生產[10]。

根據立枯絲核菌菌絲能否互相融合，將其劃分為至少14個融合群(anastomosis groups, AGs)，有些融合群可進一步劃分為融合亞群[11]。近年來，相關學者對我國江蘇[12]、湖北[13]、四川[14]、廣東[21]等地水稻紋枯病菌的致病力分化和融合群進行了廣泛研究，并取得了一些進展。然而，全國范圍內的水稻紋枯病菌致病力分化情況以及引起其致病力分化的可能因素尚未見報道。因此，從16個水稻主要種植區采集與水稻紋枯病癥狀類似的植株，進行紋枯病病原菌的分離，基于其形態學特性、菌絲細胞核熒光染色和 rDNA-ITS 序列分析進行鑒定和比較，并采用柯赫氏法則對分離自16個不同區域的病原菌致病力分化進行測定，旨在明確水稻紋枯病菌的生物學特性、致病力分化與地理來源之間的關系，為有效地預測預報和防治該病害提供一定的理論依據；同時尋找新的、致病力差異較大的菌株，為紋枯病菌與其寄主互作研究提供更加豐富的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病株：于2015年8月，采集自黑龍江、吉林、遼寧、河南、安徽、浙江、江蘇、四川、重慶、貴州、云南、湖北、湖南、廣西、廣東、福建16個水稻種植區紋枯病樣品34份。不同菌株的致病性測定試驗使用9311水稻品種。

PSA固體培養基：2%蔗糖、1.8%瓊脂粉、20%馬鈴薯，121 ℃滅菌20 min；PSA液體培養基：20%馬鈴薯、2%蔗糖，121 ℃滅菌20 min；WA培養基：1.5%瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1病樣采集及病原菌的分離 于2015年8月，分別從黑龍江等16個水稻紋枯病自然發病田中采集水稻病鞘或病葉樣本，每個采樣田塊采用對角線5點采樣法進行采樣，混合分裝進行紋枯病病原菌的分離，并描述發病樣本癥狀。病原菌的分離采用水瓊脂分離法[15]，用消毒后的剪刀剪取每個樣品病斑邊緣長寬約5 mm的病樣組織，75%的酒精消毒2 min，無菌水沖洗3次，置于裝有1/3滅菌蒸餾水的培養皿中，于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h；用鑷子夾取病樣組織塊在滅菌濾紙上吸干表面水分，平鋪于WA培養基上，于28 ℃恒溫培養箱培養48 h；當病樣組織塊周圍長出2～3 cm、呈分枝狀的菌絲時，用接種鏟在單個菌絲尖端切取3～4 mm左右的菌塊轉接到PSA培養基上進行菌落純化，每隔1 d觀察菌絲生長情況。所有的操作均在超凈工作臺中進行。

1.2.2形態學鑒定 將分離到的菌株接種于PSA平板上活化，待菌落長至平板邊緣時，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊，接種于另一潔凈的PSA培養基中央，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，每個菌株重復3皿。每隔2 h按十字交叉法測量菌落生長直徑，期間觀察菌絲的生長形態、菌核形成時間及顏色變化等。

選擇干凈無劃痕的載玻片，蒸餾水沖洗干凈，擦干后于121 ℃高壓滅菌20 min，適度烘干后，放入95%乙醇浸泡脫水，取出載玻片，用火焰去除乙醇，冷卻后立即插入分離自不同地區水稻紋枯病菌生長的培養皿中，28 ℃恒溫培養箱中培養24 h，待菌絲生長到載玻片1/2處，取出載玻片，滴取適量濃度為100 μg·mL-1的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)熒光染液于載玻片的菌絲上，蓋上蓋玻片，染色30 min，試驗在黑暗條件下進行；染色完成后取下蓋玻片，快速用1×PBS或蒸餾水沖洗干凈，以除去未結合的染液，用滅菌濾紙吸去多余水分，滴加1滴熒光封片液(0.5 mol·L-1磷酸鹽緩沖液與滅菌的80%甘油等體積混合)，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下藍光通道，觀察菌絲形態和細胞核形態，并統計不同菌株的細胞核數[16]。

1.2.3分子生物學鑒定 分子生物學鑒定 為鑒定分離到的病原菌菌株以及紋枯菌融合亞群歸屬，對分離自16個不同地區的61株病原菌進行rDNA-ITS序列分析。采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[17]。rDNA-ITS序列引物為F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′； R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反應體系采用50 μL體系：2 μL DNA模板，10 μL FastPfu Fly Buffer，5 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，1 μL FastPfu Fly 高保真酶，正反引物各1 μL，用ddH2O補充至50 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環；72 ℃延伸8 min。

1.2.4病原菌致病性測定 采用離體葉片接種法進行病原菌的致病性測定。接種材料為水稻9311品種，選取水稻劍葉，均勻地平鋪于裝有濕潤濾紙的白色瓷盤上；隨機選取分離自16個不同地區的水稻紋枯病菌各1株活化，待菌落長至平板邊緣時，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊，接種到瓷盤中放置好的葉片中部，接種后覆蓋上保鮮膜保濕，置于28 ℃恒溫光照培養箱中，每天及時往瓷盤中添加無菌蒸餾水保證葉片的濕潤環境；每株菌重復3次，以不接菌絲塊的健康葉片為對照，于接種后24、48、72、96 h觀察葉片發病情況，并統計葉片病斑大小及侵染葉面積百分比。

2 結果與分析

2.1 水稻紋枯病的為害癥狀

紋枯病菌主要為害葉鞘，嚴重時也可為害葉片、莖稈和穗部，整個生育期均可發生。發病初期，葉鞘表面出現暗綠色水漬狀斑點，隨后擴大，形成有暗褐色邊緣的橢圓形病斑，后多個病斑重疊成中央灰白色或草綠色，邊緣明顯的云紋狀。潮濕時病部出現白色粉狀霉層，后形成褐色菌核。高溫、高濕等環境條件可促使紋枯病的發生，發病后輸導組織破壞，谷粒飽滿度減小，甚至不能正常抽穗，形成大量癟谷。

2.2 水稻紋枯病的分離及形態學特征

2.2.1病原菌的分離 采用水瓊脂分離法分離得到的菌株，菌絲經過單菌絲尖端移植，轉到PSA培養基上純化。從黑龍江等16個不同地區共分離得到61株病原菌菌株(表1)。病原菌菌絲細而松散，多分枝，分枝為直角或接近45°的銳角，菌落后期基質顏色變褐，產生多個菌核。

表1 水稻紋枯病菌的分離Table 1 The isolates of the rice sheath blight pathogen

2.2.2病原菌菌落形態 觀察分離自16個不同地理來源的病原菌菌株在PSA培養基上的生長變化情況(圖1)，接種后2 h菌絲開始沿菌絲塊周圍生長，不斷蔓延，菌絲初期細且密，呈白色；24 h后，菌絲生長到整個培養基的2/3，菌絲在加快生長的同時開始不斷稠密變粗；48 h后，菌絲長滿整個平板，產生少量氣生菌絲，部分菌絲聚集成團，形成少量白色菌絲團；72 h后，氣生菌絲不斷增多，菌絲層上形成厚密的白色菌絲團，來源于廣東的菌株GD、廣西的菌株GX和河南的菌株ZZYY最先形成明顯白色顆粒狀的菌核；96 h后，菌絲逐漸變為黃褐色，GD菌株產生少量黃褐色菌核，其他菌株可見白色菌核；7 d后，菌絲顏色加深，形成大量深褐色菌核分散于培養皿中，其中菌株GD和菌株GX形成的菌核大且圓，菌核之間不相連，而湖南的菌株HN形成的菌核多集中在接種點周圍，來源于浙江的菌株HZFY、遼寧的菌株SY、安徽的菌株AH菌核形成時間緩慢，數量明顯少于其他菌株，說明不同地理來源的菌株具有一定的差異。

圖1 不同來源的病原菌菌落形態Fig.1 The colony morphology of strains isolated from different area

對分離自16個不同地理來源的61株病原菌菌株生長速率進行測定，結果表明大多數菌株生長過程比較規律，平均生長速率基本一致，為0.21～0.23 cm·h-1。在生長早期，GD菌株生長較慢，生長速率僅為0.19 cm·h-1，但10 h后菌絲生長加快，達到0.33 cm·h-1，其菌絲生長最快，平均速率為0.24 cm·h-1。而HN和CC菌株生長相對較慢，平均生長速率分別為0.17和0.18 cm·h-1。

2.2.3病原菌菌絲形態 細胞核經DAPI染色、熒光顯微鏡成像觀察菌絲及細胞核形態，結果發現，分離自16個不同地區的61個菌株細胞核在DAPI染色下均能清晰可見，基本無重合；菌絲多分枝，分枝處菌絲之間近直角或銳角，分枝處有溢縮，且分枝處多隔膜，隔膜將菌絲分成若干個單細胞，大多數細胞是多核的(圖2)。每個菌株計數約200個單細胞，對61株病原菌菌株細胞核的數量統計發現(表2)，大多數菌株的細胞核集中在6～8個，HB、GD、和AH菌株的細胞核數量偏多。但GD菌株均勻分布在菌絲的各個部位(圖2a)，而AH菌株的細胞核主要集聚在一起(圖2d)，菌絲分枝均較多。而CC菌株的細胞核明顯偏少，菌絲分枝少(圖2c)，這可能與菌株生長的環境及地理條件有一定的關系。此外，菌絲與菌絲之間常發生融合現象(圖2b)，這可能是菌絲細胞形成多核的原因之一。

圖2 菌絲細胞核DAPI染色觀察Fig.2 Karyological observation of secondary mycelium with DAPI a, c, d：菌絲被隔膜分為多細胞菌絲(箭頭)及每個細胞的細胞核數；b：菌絲的融合。a, c, d：The hyphae were separated into multicellular mycelia by septum (arrows), and nuclear number in per cell；b：Hyphal fusion (arrows). 標尺Bars: 20 μm.

菌株編號Strain ID細胞核數量Number of cell nucleus菌株編號Strain ID細胞核數量Number of cell nucleusGD4～14,大多數Most 7～10FM3～10,大多數Most 6～7GX5～12,大多數Most 6～8HN3～10,大多數Most 5～7ZZYY4～11,大多數Most 5～7WC4～9,大多數Most 6～8CQ4～14,大多數Most 6～9WJ4～14,大多數Most 6～8FJ4～13,大多數Most 6～7CC3～9,大多數Most 4～6NJ5～14,大多數Most 6～8HZFY4～12,大多數Most 6～8GZ5～13,大多數Most 7～8SY3～8,大多數Most 4～5HB5～19,大多數Most 7～10AH4～18,大多數Most 8～12

2.3 病原菌分子鑒定

以ITS序列引物對分離得到的61株病原菌基因組DNA進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測得到大小均為750 bp左右的條帶(圖3)，擴增產物回收后進行克隆，對單克隆的菌液進行測序，將測序結果在NCBI上使用nucleotide blast工具分析比對，結果顯示該61株菌株與RhizoctoniasolaniKX674518的同源性達到100%。利用MEGA 6軟件對立枯絲核菌不同融合群及分離菌株ITS序列進行聚類分析，繪制分析系統樹，結果顯示所分離得到的菌株均與RhizoctoniasolaniAG1IA聚為一類(圖4)，表明分離到的61株菌株均是Rhizoctoniasolani,且屬于AG1IA融合群。

2.4 病原菌致病性測定

圖3 紋枯病分離菌株ITS-PCR擴增電泳圖Fig.3 PCR amplification of the ITS sequence of R. solani isolates M:DNA marker.

圖4 對立枯絲核菌不同融合群及分離菌株ITS序列的聚類分析Fig.4 Clustering analysis of ITS sequence of different R. solani isolate strains

通過離體水稻葉片接種GD、GX、ZZYY、CQ、FJ、NJ、GZ、HB、FM、HN、WC、WJ、CC、HZFY、SY和AH 16株病原菌進行致病性測定，結果表明16株病原菌均能引起水稻葉片發病，且引起的癥狀特點基本一致，均產生云紋狀病斑紋枯病典型癥狀。采用水瓊脂分離法從發病葉片中再次分離病原菌，經鑒定與原接種物一致。

對不同地理來源的16株病原菌菌株致病性進行了測定，接種24 h后病原菌菌絲在葉片上大量蔓延伸展，接種菌株GX、FJ、NJ的葉片首先出現較小的褐色病斑；48 h后接種大部分菌株的葉片均開始產生水紋狀病斑，GD菌株產生3個左右病斑，較其他的菌株多，菌株GX最先形成云紋狀的大病斑，病斑中間部位呈灰白色，邊緣呈棕褐色，病斑已延伸至菌絲塊周圍2 cm處，菌株FJ、HZFY、NJ、CQ、ZZYY、WJ、GZ、FM、CC、HB、WC和HN也開始產生1～2個較小的邊緣清晰可見的病斑，而菌株SY、AH未產生病斑；72 h后接種菌株SY、AH的葉片開始產生第一個病斑，大部分菌株產生的病斑開始增多且在葉片上擴散，比較而言，菌株HZFY產生的病斑少且小，只分布在菌絲塊周邊，沒有擴散；接種侵染96 h后對不同菌株侵染的葉片病斑大小及占葉面積的百分比進行統計(圖5)，結果表明菌株GD、GX侵染的葉片病斑大，病斑顏色較深，病斑遍布大半張葉片，導致葉片從接種點至葉尖局部變為黃色，致病力較強，而CC、WC、WJ、AH、SY、HZFY菌株侵染產生的病斑較小，多集中在接種點周圍，零星分布，沒有擴散至整個葉片，葉片沒有變黃的跡象，致病力相對較弱。

圖5 不同菌株感染水稻葉片96 h后發病情況Fig.5 The pathogenicity comparison of different strains infecting the rice leaves for 96 hours later

3 討論

本研究首次從我國各水稻種植區采集分離水稻紋枯病病原菌。研究了不同地理來源的紋枯病病原菌在人工培養基上的菌絲生長差異及菌落形態變化。結果表明，生長后期產生的褐色菌核結構是其典型菌落特征。大部分菌株之間平均生長速率差異不大，部分菌株具有一定的差異。形成的菌核分為大且圓，菌核之間不相連和集中在接種點周圍兩種類型。

Flentje等[17]曾報道過R.solani核的分布情況，且真菌細胞核數量變化也可以作為菌種的分類標準。本實驗用熒光染料DAPI染色紋枯病病原菌菌絲，對其細胞核進行了觀察。結果表明菌絲體細胞為多核，不同地理來源的菌株細胞核數量具有明顯差異，來源于黑龍江、遼寧、吉林等地的菌株細胞核數量較其他地區少，可能由于北方的地理環境，使得菌絲生長適宜條件的持續時間少，菌絲進化的速度慢于高溫高濕地區的菌株。

ITS是真菌核糖體DNA 18S和28S基因之間的序列片段[18]，能鑒定真菌屬、種之間的堿基差異[19]。陳雨等[20]利用ITS序列分析對田間早期不顯癥的水稻稻粒黑粉病樣本進行發病監測，可提早預知該病的發生，并進行合理的防控，減輕病害損失。本試驗利用ITS序列分析對分離到的61株病原菌菌株進行了融合群測定，結果表明61株菌株均與RhizoctoniasolaniAG1IA聚為一類，說明分離到的61株菌株均屬于AG1IA融合群，這與Kuninaga等[21]和李華榮[22]的研究結果一致。也有報道從水稻上分離到了AG1IB、AG1IC融合群菌株，但以水稻為寄主的主要是AG1IA融合群。

使用分離到的病原菌菌株回接試驗表明，不同地理來源的病原菌菌株均侵染水稻葉片，并產生云紋狀病斑的紋枯病癥狀，進一步從柯赫氏法則的角度對分離菌株進行了鑒定[23]。分離自不同地區的紋枯病病原菌致病力不同，其中來源于廣東、廣西、福建、重慶等地的菌株致病力較強，而黑龍江、吉林、遼寧等地區的菌株致病力較弱，由于紋枯病在高溫高濕條件下發病較重，而南方稻區高溫高濕的環境條件正好為病原菌的侵染循環提供了良好的媒介，因此不同地理來源的菌株其致病力有明顯差異，這與周而勛等[24]的研究相一致，說明在不同的生態環境下，同一菌群的菌株間由于受地理環境影響，可能出現較大的遺傳差異，而這些遺傳差異可能是導致其致病力不同的原因。

致病力較強的廣東、廣西等地菌株最先開始形成褐色菌核，在后期生長過程中菌核大且完整，菌核間不相連，使用菌核接種時，萌發時間短，菌絲生長速度較快，而對于致病力較弱的遼寧、安徽、浙江等地菌株不僅形成菌核時間晚，而且最終形成的菌核小、數量少。表明病原菌致病力與其菌核數量及結構相關，這與鄒成佳等[25]對華南三省區水稻紋枯病菌致病力測定所得的結論不同，他們認為菌核數量與其致病力之間沒有直接聯系，但作為重要侵染源，菌核數量的多少也是影響病害發生的一個重要因素，這可能是由于病原菌分布的地域較近，菌核數量和形態差異不大。對不同地理來源立枯絲核菌致病力的測定、細胞核及生長狀況的觀察，有助于了解同一種屬不同分離菌的生物學差異，進一步揭示立枯絲核菌的演化歷史、進化機制以及適應環境等問題，以期從遺傳背景上找到病原菌致病力分化的原因，為防控該病害提供新的策略。