益智不同部位化學(xué)成分及清除DPPH自由基活性比較

世鵬

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637000

益智為姜科植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq)的干燥成熟果實(shí)，具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾的功效[1]。研究顯示益智含有萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、二苯庚烷類(lèi)等化學(xué)成分，具有神經(jīng)保護(hù)、提高學(xué)習(xí)記憶、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、強(qiáng)心和鎮(zhèn)靜催眠等廣泛的藥理活性[2-6]。多部中國(guó)藥典記載益智(完整果實(shí))需除去外殼(益智殼)種子團(tuán)(益智仁)入藥或進(jìn)一步炮制使用，而占益智果實(shí)重量約30%的外殼則作為廢物丟棄，在一定程度上造成了益智藥材資源的浪費(fèi)[1，7，8]。目前，有關(guān)益智殼與仁的化學(xué)成分的比較研究多集中揮發(fā)油[9-12]、總黃酮、總多糖[12]和寡聚糖[13]等大類(lèi)成分的含量測(cè)定以及揮發(fā)油[9-11,14]化學(xué)成分的分析。而采用HPLC法對(duì)益智仁與益智殼中整體化學(xué)成分的對(duì)比分析較少，且未見(jiàn)有其抗氧化活性比較研究報(bào)道。基于此，實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上[6]，分別采用UV和HPLC對(duì)益智、益智仁和益智殼的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比分析，并采用DPPH法比較了抗氧化活性的差異，以期為更加合理利用益智藥材資源提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 益智(批號(hào)：140101)藥材購(gòu)于南充五星金方中藥飲片有限公司，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李毅主任中藥師鑒定為姜科植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq)的干燥成熟果實(shí)，益智藥材剝開(kāi)，人工分離得到益智仁和益智殼。1,1-二苯基苦基苯肼(批號(hào)：034K1071，sigma公司)，甲醇(批號(hào)：201309230，成都市科龍化工試劑廠)，水為超純水(自制)。

1.2 儀器 Agilent1220高效液相色譜儀；KQ3200 DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司) ；Ohaus Discovery十萬(wàn)分之一電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；Epoch 微孔板分光光度計(jì)(美國(guó)BIOTEK公司)；島津1750紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 取益智不同部位樣品粗粉約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 益智不同部位樣品UV分析 取“2.1”項(xiàng)下方法供試品溶液，加適量甲醇稀釋40倍，于紫外分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄光譜圖。整體而言，益智仁和益智UV圖譜峰形較為相似，僅為吸收強(qiáng)度有所不同，但兩者與益智殼在260～285 nm則差異明顯，益智殼在該波長(zhǎng)區(qū)間的吸光度更強(qiáng)、變化更緩慢，呈明顯的平臺(tái)。此外，益智、益智仁和益智殼在217 nm處均有一明顯的吸收峰，吸收強(qiáng)度大小依次為益智殼、益智和益智仁。結(jié)果如圖1所示。

2.3 益智不同部位樣品化學(xué)成分HPLC分析

2.3.1 HPLC色譜條件[6]色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～15 min，35%A；15～32 min，35%～70% A；32～48 min，70%～77% A)；流量：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 樣品測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在同一色譜條件下，益智仁與益智HPLC色譜圖相似性較高，僅存在個(gè)別色譜峰有無(wú)及部分色譜峰峰面積大小的差異。益智仁和益智殼HPLC色譜圖則存在較大差異，益智仁HPLC色譜圖中前30 min色譜峰數(shù)量遠(yuǎn)多于益智殼，而在37～39 min，益智殼則出現(xiàn)3個(gè)新的色譜峰。進(jìn)一步通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)了樣品HPLC色譜圖中白楊素、楊芽黃素和圓柚酮的色譜峰。其中，白楊素和楊芽黃素在各樣品中峰面積的大小順序均為：益智殼﹥益智﹥益智仁，圓柚酮在各樣品中峰面積的大小順序?yàn)椋阂嬷侨施円嬷签円嬷菤ぃ⑶以谠摍z測(cè)條件下，益智仁未檢出楊芽黃素，結(jié)果如圖2所示。

2.3.3 相似度分析 采用由國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)》軟件，選取中位數(shù)法自動(dòng)匹配，對(duì)益智不同部位樣品HPLC圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算相似度。結(jié)果顯示，益智仁與益智相似度較高，達(dá)0.990，而與益智殼相似度較低，為0.862，見(jiàn)表1。

表1 益智不同部位樣品HPLC圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

2.4 益智不同部位樣品清除DPPH自由基活性比較

2.4.1 DPPH溶液配制 精密稱(chēng)取DPPH適量，加甲醇配置濃度為170 μmol/L溶液，避光保存。

2.4.2 清除DPPH自由基作用 按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，加甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度(相當(dāng)于生藥量)的供試品溶液。取0.15 mL供試品溶液，與0.15 mL DPPH溶液置96孔板上，混勻后室溫避光放置60 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度Ai，同時(shí)測(cè)定0.15 mL甲醇與0.15 mL DPPH溶液A0，計(jì)算清除率，公式為：清除率=(1-Ai/A0)×100%。以清除率(Y)對(duì)藥物質(zhì)量終濃度(X)進(jìn)行對(duì)數(shù)回歸，求出清除率為50%時(shí)藥物的質(zhì)量濃度(IC50)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 益智不同部位清除DPPH自由基活性結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)采用UV法對(duì)益智不同部位樣品化學(xué)成分整體特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)益智仁和益智UV圖譜更為相似，僅存吸收強(qiáng)弱的區(qū)別，但與益智殼的UV圖譜部分特征峰的峰形、位置和吸收強(qiáng)度有明顯不同，暗示益智和益智仁與和益智殼中所含化學(xué)成分的種類(lèi)和含量存在較大差異。進(jìn)一步采用HPLC法分析了益智不同部位的化學(xué)成分組成，直觀發(fā)現(xiàn)益智仁與益智HPLC色譜圖相似性較高，僅存在個(gè)別色譜峰數(shù)量及部分色譜峰峰面積大小不同；而益智仁與益智殼的HPLC色譜圖區(qū)別明顯，前者色譜圖中色譜峰數(shù)量明顯多后者色譜圖中的，這與吳德玲等研究結(jié)果相似[12]。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)照品與HPLC圖譜中部分色譜峰比對(duì)，發(fā)現(xiàn)益智中白楊素和楊芽黃素等黃酮類(lèi)成分主要集中在益智殼中，而萜類(lèi)成分圓柚酮?jiǎng)t主要集中在益智仁中。相似度分析結(jié)果也顯示，益智仁與益智相似度較高，達(dá)到0.990，益智殼與益智和益智仁相似度較低，相似度分別為0.903和0.862，該結(jié)果與直觀分析結(jié)果較為一致。

清除DPPH自由基活性測(cè)定結(jié)果顯示，益智、益智仁和益智殼均具有一定程度的清除DPPH自由基活性，但強(qiáng)弱有所不同，其中以非傳統(tǒng)藥用部位的益智殼清除DPPH自由基活性最強(qiáng)，值得進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用。實(shí)驗(yàn)僅比較了益智仁和益智殼甲醇提取物清除DPPH自由基的活性，其清除DPPH自由基的活性成分以及對(duì)其它自由基是否具有清除活性尚有待進(jìn)一步的研究。