酶解法與HPLC法相結(jié)合檢測金錢草膠囊在人體內(nèi)藥代動力學(xué)

暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院/深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518040

金錢草也被成為神仙對坐草、地蜈蚣，其味酸、苦，可供藥用，有清熱利尿、消炎解毒、殺蟲之功[1]。金錢草膠囊是當(dāng)前臨床上使用新鮮或干燥金錢草作為原料的中藥制劑，其主要有效成分為槲皮素[2]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，金錢草膠囊在肝膽和泌尿系統(tǒng)結(jié)石、濕熱黃疸、腎炎水腫以及跌打損傷治療中均具有較好效果[3]。因?yàn)樵撍幬餅橹兴幹苿?，不良反?yīng)較少，因此在臨床上應(yīng)用越來越廣泛。當(dāng)前臨床上主要采用高效液相色譜-紫外檢測方法對藥物中槲皮素及其在人體中藥代動力學(xué)情況進(jìn)行測定[4]。為進(jìn)一步探究金錢草膠囊在人體內(nèi)藥代動力學(xué)，本研究先使用酶解法獲得其有效成分游離槲皮素苷元，之后再使用高效液相色譜法對血藥濃度進(jìn)行檢測。

1 資料與方法

1.1 受試者選擇 15名健康男性志愿者，體質(zhì)量63～73 kg，平均體重(62.1±6.9)kg；年齡20～29歲，平均年齡(25.2±1. 4)歲；身高160～172 cm，平均身高(167.5±4.1)cm；志愿者的年齡、體重等基本資料均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。納入標(biāo)準(zhǔn)：不吸煙，不嗜酒，身體健康；無心、肝、腎、肺、消化道系統(tǒng)等疾病史；精神狀態(tài)正常；體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果均正常；無金錢草膠囊等藥物過敏史；試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期間未使用任何藥物。所有志愿者均簽署知情同意書，自愿參加此次研究，且該研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)方案 志愿者于試驗(yàn)前1日和試驗(yàn)期內(nèi)禁止吸煙和飲用酒類、咖啡類或果汁飲料；試驗(yàn)前1 日晚17：00統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)晚餐，禁食12 h。次日早晨空腹單次口服金錢草膠囊1.6 g，用200 mL溫開水吞服；服藥2 h 后方可再飲水、統(tǒng)一進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐。分別于給藥前及給藥后0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 肘靜脈取血4 mL，置于干燥管中，靜止30 min，10000 r/min離心10 min，取上清液置-75℃冰箱中做好標(biāo)記保存。

1.3 槲皮素對照品溶液配制 精密稱取槲皮素對照品10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為400 μg/mL的槲皮素對照品貯備液，置4 ℃冰箱中備用。

1.4 血漿樣品的提取與分離 將血漿樣品于室溫解凍后，精密量取志愿者血漿樣品0.5 mL置于離心管中，0.58 mol·L-1冰醋酸20 μL 和10 kU·mL-1β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，將PH調(diào)至4.5～5.0，旋渦30 s混勻后，37 ℃水浴30 min，水解完畢后，加入對照品槲皮素溶液10 μL，旋渦振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，50 ℃水浴氮?dú)饬鞔蹈桑?.8 mL甲醇溶解殘渣，旋渦振蕩30 s，10 000 r/min離心3 min，進(jìn)樣量20 μL進(jìn)行測定。

1.5 統(tǒng)計分析 采用DAS ver 2.1.1軟件對志愿者不同時間的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并計算各藥代動力學(xué)參數(shù)，梯形法計算AUC。

2 結(jié)果

2.1 酶解條件 血漿樣品處理過程分別加入320、160、80、40、20、10、5、4、3、2、1 kU·mL-1不同濃度配制的β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，結(jié)果顯示當(dāng)酶濃度為10 kU·mL-1時水解效率最高。另考察了酶解時間30 min 達(dá)到峰值。

2.2 精密度與準(zhǔn)確度 制備含槲皮素對照品溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.16、2.40、8.00 μg/mL的3種含藥血漿質(zhì)控樣品，每批每個濃度各5份，按“血漿樣品的提取與分離”項下方法操作，連續(xù)做6 d，并且在1 d內(nèi)重復(fù)測定6次，記錄槲皮素峰面積，實(shí)測濃度計算日內(nèi)、日間精密度及回收率，見表1。

表1 精密度、準(zhǔn)確度與回收率結(jié)果

2.3 人體內(nèi)藥代動力學(xué)研究 15名健康男性志愿者口服1.6 g金錢草膠囊后，金錢草膠囊的平均血藥濃度-時間曲線見圖1，主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。

表2 口服1.6 g金錢草膠囊人體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)

3 討論

金錢草膠囊以中藥金錢草作為原材料，其主要有效成分為槲皮素。槲皮素為多羥基黃酮類化合物，其主要存在形式為苷元[5-7]。為了探討金錢草膠囊的藥代動力學(xué)情況，筆者使用酶解法與高效液相色譜相結(jié)合的方法對藥物中主要有效成分進(jìn)行血藥濃度測定。

槲皮素在經(jīng)人體胃腸道吸收并且進(jìn)入血液后往往與血液中其他成分相結(jié)合，因此若要對游離槲皮素進(jìn)行檢測必須對其進(jìn)行水解處理[8-9]。以往實(shí)驗(yàn)在對槲皮素進(jìn)行水解時往往采用酸水解，但是該方法卻需要加熱回流因此對于樣本量較少的研究不太適用。本研究中采用酶解法對金錢草膠囊中槲皮素進(jìn)行分離萃取，通過對水解條件、試劑以及提取方式等進(jìn)行優(yōu)化取得了較好的效果。使用β-葡萄糖醛酸苷酶液對槲皮素進(jìn)行分離能夠有效提取苷元。本研究在血漿樣本中加入不同濃度的β-葡萄糖醛酸苷酶液后發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶濃度在10 kU·mL-1時水解效率最高。對于分離金錢草膠囊中有效成分的水解條件給了很好的啟示。血漿樣本的色譜峰具備較好的分離度，同時，檢測的精密度和準(zhǔn)確性均能夠符合藥代動力學(xué)檢測的要求。同時本研究還對酶解的條件問題進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，當(dāng)酶濃度為10 kU·mL-1時水解效率最高，并且在酶解時間30 min時達(dá)到峰值。

另外本研究顯示，15名受試者在口服金錢草膠囊后其體內(nèi)槲皮素苷元的Tmax存在較大波動，同時還有5名患者存在雙峰現(xiàn)象，這樣進(jìn)一步提示肝腸循環(huán)可能也參與了金錢草膠囊在人體內(nèi)胃腸道吸收的過程。另外，受個體差異的影響，β-葡萄糖醛酸苷酶在不同人體內(nèi)活性也存在較大差異，這也是造成Cmax與AUC存在較大差異的原因。

綜上，本研究結(jié)果顯示，酶解法聯(lián)合高效液相色譜法能夠有效對金錢草膠囊制劑的生物學(xué)特性以及藥代動力學(xué)情況進(jìn)行有效分析，為今后藥學(xué)研究以及臨床更加合理使用藥物提供了參考。