響應面法優化白刺花總黃酮提取工藝研究

紅河衛生職業學院，云南 蒙自 661199

白刺花又名苦豆花、白花，為豆科小灌木植物，在南方各地的山坡、田埂及丘陵地帶均有大量分布，有的荒地上甚至成為其主要的植被分布[1]。云南多數地區有食用其花的習俗，為云南紅河州彝族、白族、苗族、哈尼族等少數民族習用[2]。白刺花具有清熱利濕、消積通便、殺蟲止癢的功效，用于腹痛腹脹、食積蟲積、痢疾；帶下陰癢；疥癩瘡癬[3]；其花有清熱解暑作用，可用于暑熱煩渴等[4]。當地百姓用其泡茶飲用，在降脂降糖上具有一定效果，但未見文獻報道白刺花有降血脂及降血糖的作用。白刺花含黃酮及生物堿，有抗炎、抗過敏的作用[5]。基于白刺花的各種優勢特點，筆者欲將野生白刺花的葉、花開發為保健速溶茶，通過試驗研究，優化出白刺花總黃酮的最佳提取方法，為白刺花保健速溶茶的開發提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 A580型雙光束紫外可見分光光度計(翱藝儀器有限公司) ；ML204分析天平(上海亞榮儀器有限公司)；FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司) ；101型電熱鼓風干燥箱北京市永光明醫療儀器有限公司) ；HH-4 型恒溫水浴鍋(常州潤華電器有限公司) ；DLF-18型流水式中藥粉碎機(溫州頂歷醫療器械有限公司) ；RE-3000A 型旋轉蒸發器(上海亞榮儀器有限公司) 。

1.2 材料 蘆丁對照品(批號:20160427，上海金穗生物科技有限公司) ；白刺花采自紅河州豆科小灌木植物白刺花的花；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，購于天津市致遠化學有限公司。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備[6]精密稱取干燥的蘆丁對照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，至水浴鍋上微熱使蘆丁溶解，冷卻后，在甲醇至刻度，搖勻，即得每1 mL含蘆丁0.2 mg的對照品溶液。

2.1.2 測定波長的選擇 取對照品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液1 mL搖勻，再放置6 min，加1 mol / L氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，于波長400～600 nm 范圍內掃描，500 nm波長處有一最大吸收峰，故選擇500 nm為測定波長。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項下方法，選擇500 nm波長，用相應的試劑作空白，測定每種溶液的吸光度，以吸光度Y做橫坐標，濃度X做縱坐標，繪制標準曲線，見表1及圖1。回歸方程得Y= 21.725X-0.0012，r2=0.9998，結果顯示，蘆丁在 0.008～0.04 mg/mL內具有良好線性關系。

表1 蘆丁對照品線性關系考察表

2.1.4 供試品溶液的制備 將白刺花原料粉碎，過60目篩，按實驗設定的條件進行提取，提取液減壓抽濾，濾液定容，即得供試品溶液。

2.1.5 樣品中總黃酮的含量測定 精密量取2 mL供試品溶液置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”項方法測定吸光度，計算總黃酮提取率。

式中:C 為提取總黃酮的質量濃度，mg/mL；V1 為測量液定容體積，25 mL；V2為測量時量取的體積，2 mL；V3為提取液定容體積，100 mL；m為稱取樣品的質量，5000 mg。

2.2 單因素考察

2.2.1 加液量對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定乙醇濃度60%，提取時間1.5 h，提取溫度 80 ℃ 等實驗因素，考查5、10、15、20、25倍加液量下總黃酮的變化。由圖2可知，在加液量為20倍以前，白刺花總黃酮的提取率隨加液量倍數的增大而增大，但加液量達到20倍后，總黃酮的提取率呈下降趨勢，即20倍的加液量的提取率達到高峰，因此加液量為20倍時較為合適。20倍加液量后總黃酮提取率呈下降趨勢可能是溶劑體積較大，非黃酮類成分溶解度增大而大量溶出，從而導致白刺花的總黃酮提取率的下降。

2.2.2 提取時間對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，乙醇濃度為 60% ，提取溫度為 80 ℃等試驗因素，考察提取時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h時白刺花中總黃酮的提取率。由圖3可知，在提取時間為2 h 時白刺花總黃酮提取率最高，繼續延長提取時間，提取率會降低，在提取時間為3 h時提取率最低，故選提取時間為2 h為最優提取時間。圖上還反應出提取時間太長，都會使白刺花中總黃酮被破壞，以致提取率下降。

2.2.3 乙醇濃度對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時間為2 h，提取溫度為80 ℃，考查乙醇濃度分別為40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇時白刺花中總黃酮的提取率。由圖4可知，隨著乙醇濃度加大，提取液的極性越接近提取物的極性，提取率不斷提高，當乙醇濃度為70%時，白刺花中總黃酮的提取率達到最高，70%后再增大乙醇濃度提取率將降低，是因為乙醇濃度太高，白刺花中醇溶性雜質及色素等成分溶出增多。因此70%的乙醇濃度為最優乙醇濃度。

2.2.4 提取溫度對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時間2 h，乙醇濃度為70%等實驗因素，考查提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃時白刺花中總黃酮的提取率。由圖5可知，溫度升高，提取率在增高，當溫度達到70 ℃ 時，白刺花中總黃酮提取率最高，當溫度增大到80 ℃時，總黃酮提取率有所下降，當溫度增大到90 ℃時，總黃酮提取率下降明顯。因此選擇溫度為70 ℃為白刺花總黃酮提取最優溫度。

2.3 響應面法優化白刺花中總黃酮提取工藝 在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇濃度(A)、加液量(B)、提取溫度(C) 和提取時間(D),利用 Design-Expert 8.0.6軟件中的 Box-Behnken 軟件優化白刺花中總黃酮提取條件。以白刺花總黃酮提取率為響應值，進行響應面分析試驗[7-8]，以 A、B、C、D 為自變量，以總黃酮提取率為響應值(Y) 進行實驗設計，各因素水平設計見表2。白刺花Box-Behnken中心組合試驗設計和結果見表3。

表2 白刺花中總黃酮提取響應面設計表

表3 白刺花Box-Behnken中心組合試驗設計和結果

續表3表3 白刺花Box-Behnken中心組合試驗設計和結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析試驗結果，以總黃酮提取率為響應值，對實驗數據進行二次多項式回歸擬合，得回歸方程為:

Y=0.92+0.018A+0.023B+7.500E-003C+0.035D+0.021AB-2.500E-003AC+0.016AD+0.034BC+7.750E-003BD-7.500E-003CD-0.093A2-0.075B2-0.043C2-0.043D2

使用Design-Expert 8.0.6軟件回歸分析對方程及各因子進行方差分析。由表4可知，以白刺花的總黃酮提取率為響應值，回歸方程顯著性檢測P﹤0.0001，表明所得二次方程模型極顯著，而失擬項的P值為0.9986，不顯著，R2=0.9921，表明回歸方程模型與實際實驗擬合性比較好，實驗誤差較小，說明采用響應面法優化白刺花中總黃酮提取工藝是可行的，具有參考性[9]，其中各影響因素對白刺花總黃酮提取率的影響順序為:提取時間>加液量>乙醇濃度> 提取溫度。

表4 響應面法優化白刺花總黃酮提取率的方差分析表

續表4表4 響應面法優化白刺花總黃酮提取率的方差分析表

表4中一次項乙醇濃度、加液量、提取時間的P值都小于 0.0001，說明都對白刺花總黃酮的提取率有極顯著的影響，提取溫度的P值為0.0064，小于0.01，表明其對白刺花總黃酮的提取率有高度顯著的影響; 交互項BC對白刺花總黃酮提取率的影響極顯著，AD對白刺花中總黃酮提取率的影響高度顯著，其余不顯著; 二次項 A2、B2、C2、D2均達到極顯水平說明各因素對白刺花中總黃酮的提取率存在交互影響，而不是簡單的線性關系[10]

將表3中的試驗結果進行響應面的曲面分析，在影響因素中選擇其中兩個交互的因素對白刺花中總黃酮的提取率的影響進行分析，把其他因素固定為零。根據回歸方程，考察各影響因素響應曲面的形狀，分析各因素對白刺花中總黃酮提取率的影響，結果如圖6～11所示。

根據Design-Expert 8.0.6軟件響應曲面優化原理，3D曲面圖的坡度越大，說明響應值對于操作條件的改變影響越大; 反之曲面圖坡度越小，操作條件改變對響應值的影響也就越小[11-12]。圖 6～11反映了乙醇濃度、加液量、提取溫度 和提取時間四個因素交互作用對白刺花中總黃酮提取率的影響，其中乙醇濃度及加液量(圖6)、乙醇濃度及提取時間(圖8)、提取溫度及加液量(圖9)交互作用3D曲面圖坡度較大，表明這三組對白刺花中總黃酮提取率的交互作用明顯。

通過響應面分析優化，用Design-Expert 8. 0. 6軟件對回歸方程進行計算，得到白刺花中總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度 71.59% ，加液量為21.15倍，提取溫度為71.32 ℃，提取時間2.22 h；在此條件下模型預測總黃酮提取率為0.93118% 。考慮到在實際操作中，設備等各條件有限，對最佳工藝條件修正為:乙醇濃度 72% ，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時間為133 min。

2.4 驗證實驗 根據所修正的條件進行了3次平行驗證試驗，結果白刺花中總黃酮的平均提取率為0.9273%，與模型相對誤差為0.42%，說明實驗結果與模型擬合較好，利用響應面優化法優化所得到的提取工藝參數準確可靠。

3 討論

白刺花中黃酮類化合物含量豐富，具有非常好的藥用、食用、保健作用價值和開發利用前景。本研究以干燥的白刺花的花粗粉為原料，以乙醇為提取溶劑，在單因素試驗基礎上，用 Design-Expert 8.0.4 軟件對白刺花提取工藝參數進行響應面試驗優化。結果表明最佳的提取工藝條件為:乙醇濃度 72%，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時間為133 min。優化所得到的最佳提取工藝是提取白刺花中總黃酮的有效途徑，為開發保健速溶茶提供可靠的依據。