熟地黃多糖聯合同步放療對鼻咽癌增殖轉移的影響研究*

李 哲，劉樹佳，翁玉玲，陳進杰，陳加家

1.廣東省東莞市萬江醫院(東莞523000)，2.廣東省東莞市人民醫院(東莞523000)

主題詞 鼻咽腫瘤/治療 熟地黃 放射療法

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方局部地區和東南亞發病率較高的惡性腫瘤。患者鼻咽局部(多位于鼻咽腔側壁)表現為細胞病理學的改變，從而影響到病變部位的解剖結構，該病患者往往并不適合手術治療[1-3]。熟地黃多糖(Rehmanniae glutinosa polysaccharide，RGP)是熟地黃的主要有效成分之一，可以影響TNF-α JAK/STATs信號通路調控基因，調控鼻咽癌細胞TNF-α、STAT3表達，進而展現抗腫瘤活性，促使鼻咽癌細胞凋亡，下調其遷移活性的作用[4]。為了探究熟地黃多糖聯合同步放療對鼻咽癌增殖轉移的影響，特進行了臨床對照研究，現報道如下。

對象與方法

1 研究對象 2016年8月至2017年11月期間，隨機抽取門診中符合研究要求的患者160例。所有患者均已簽署知情同意書，本研究獲得我院醫學倫理委員會的批準。其診斷、納入和排除標準具體如下。診斷標準：符合中國抗癌協會制定的鼻咽癌診斷標準。納入標準：所有患者預期生存期在6個月以上；年齡18歲以上；患者入院初未接受過化療、放療；無精神疾病可積極配合治療有良好依次性；對治療用藥無相關禁忌證、明顯過敏反應；KPS評分大于等于70分[5-7]。排除標準: 經檢查發現、其他惡性腫瘤，曾接受化療、放療、靶向藥物治療，患者病灶出現轉移，女性患者有妊娠、哺乳現象，未簽署知情同意書，無法良好配合、依從性差者。排除標準：排除合并有心臟病、心功能障礙或合并有其他消耗性疾病者；排除妊娠或哺乳期患者；已經發生遠處轉移的患者；排除合并有其他惡性腫瘤病史的患者；依從性不強，不按照試驗要求進行治療及病情觀察者；有嚴重肝腎功能不全的患者。

2 分組及治療方法 根據患者入院時間單雙日進行1∶1匹配，均分為對照組和實驗組，每組均為80例患者，其具體治療方法如下。①對照組(順鉑單藥進行同步放療)，具體根據NCCN指南推薦順鉑周方案同步放化療。具體方法如下：入院后使用CT掃描、定位患者放療區域，結合MRI影像(或PET-CT)標記腫瘤靶區(GTVnp、頸部淋巴轉移灶(GTVnd)、高危臨床靶區域(CTV1)、低危臨床預防照射區(CTV2)。患者取仰臥位，每日1次使用瓦里安生產直線加速器進行放射治療，其中腫瘤靶區劑量為70 Gy，頸部淋巴轉移灶劑量為68 Gy，臨床靶區1、靶區2 劑量分別為62 Gy、52 G y，4次/周，累積放射30次左右[8-10]。②實驗組(同步放療基礎上使用熟地黃多糖進行聯合治療)：在對照組中同步放療基礎上使用熟地黃多糖(每天服用熟地黃多糖提取物，劑量為5 g，每次加水中服用)進行聯合治療[11]。

3 觀察項目 患者入院初進行基本情況(性別、臨床分期、病理類型、年齡、病程等)的數據采集，化療前后進行相關指標的檢測，化療后評估臨床療效，具體內容包括如下幾點。①CNE細胞生長抑制率：采用MTT法檢測CNE細胞的增殖抑制率，將細胞懸液計數后按每孔(10×10/ml)細胞接種于96孔板，每孔加入10 μl MTT試劑(5 mg/ml)繼續培養4 h后移出。棄上清液，每孔加入160 μl DMSO在微量振蕩器上振蕩大約12 min，直至完全溶解。用酶標儀檢測吸光度，空白組調零，記錄各組檢測結果，按照公式細胞抑制率(%)=(1-實驗組值A490/對照組值A490)×100%。實驗重復5次，取平均值[12-15]。②Bcl-2、Bax、Caspase-3 表達含量：抽取患者清晨空腹靜脈血，肝素抗凝，PBS 混勻稀釋，制備細胞裂解液，加入等體積淋巴細胞分離液，低速離心后輕輕吸取淋巴細胞層液體， RPMI1640 洗滌5次。加入含10.0%FBS 的RPMI1640 培養液將細胞重懸，常溫下培養10 h，去除貼壁細胞。采用熒光分光光度計分析法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3含量，檢測條件為激發光波長380 nm，發射光波長為430～460 nm[14，16-18]。③淋巴細胞亞群：采用流式細胞儀測定淋巴細胞亞群，將分離純化后的淋巴細胞收集并調整至(5× 106個/ml)，鋪板后在常溫下進行培養。加入等體積PBS溶液培養76 h，流式細胞儀測定CD80(+)、CD86(+)百分比。④臨床療效：分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩定(SD)及進展(PD)，臨床有效=CR+PR。完全緩解，腫瘤減少50.0%以上，用藥治療后癥狀明顯改善，經檢查各項生命體征穩定；部分緩解，腫瘤減少30%以上，且病癥有改善，各項生命體征檢查趨于平穩；穩定，腫瘤增加在15%以下或減少30%以下；進展，疾病癥狀未改善，病情加重治療無效[19]。

4 統計學方法 采用SPSS l8.0統計學軟件建立數據庫并分析，多組計數資料的比較使用卡方檢驗(T<1的情況下使用精確概率)，正態分布計量資料的比較使用兩個獨立樣本t檢驗的方法進行統計分析，檢驗水準取0.05，雙側概率。

結 果

1 兩組患者基本情況比較 見表1。兩組患者性別、臨床分期、病理類型、年齡、病程指標差異沒有統計學意義(P>0.05)。

表1 兩組患者基本情況比較

2 兩組患者治療前后CNE細胞生長抑制率比較 見表2。兩組患者治療前后CNE細胞生長抑制率的比較，差異有統計學意義(P<0.05)，隨著時間遷移，CNE細胞生長抑制率呈現顯著上升趨勢。治療前和治療1周后比較，兩組患者CNE細胞生長抑制率差異無統計學意義(P>0.05)；治療4周和治療8周后比較，CNE細胞生長抑制率差異有統計學意義(P<0.05)，實驗組CNE細胞生長抑制率顯著高于對照組。

3 兩組患者治療前后Bcl-2、Bax、Caspase-3 表達含量比較 見表3。兩組患者治療前后Bcl-2、Bax、Caspase-3 表達含量差異有統計學意義(P<0.05)，隨著時間遷移，Bcl-2表達含量呈現顯著下降趨勢，Bax、Caspase-3 mRNA表達含量呈現顯著上升趨勢。治療前和治療1周后比較，兩組患者Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達含量差異無統計學意義(P>0.05)；治療4周和治療8周后比較，Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達含量差異有統計學意義(P<0.05)，實驗組Bcl-2表達含量顯著低于對照組，Bax、Caspase-3 mRNA表達含量顯著高于對照組。

表2 兩組患者治療前后CNE細胞生長抑制率比較

表3 兩組患者治療前后Bcl-2、Bax、Caspase-3 表達含量比較 (光密度值)

4 兩組患者治療前后CD80和CD86陽性率比較 見表4。兩組患者治療前后CD80和CD86陽性率的比較，CD80和CD86陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，隨著時間遷移，CD80和CD86陽性率呈現顯著下降趨勢。治療前和治療1周后比較，兩組患者CD80和CD86陽性率差異無統計學意義(P>0.05)；治療4周和治療8周后比較，CD80和CD86陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。實驗組CD80和CD86陽性率顯著低于對照組。

表4 兩組患者治療前后CD80和CD86陽性率比較 [例(%)]

5 兩組患者臨床療效比較 見表5。實驗組臨床療效顯著優于對照組(P<0.05)。

表5 兩組患者臨床療效的比較 [例(%)]

討 論

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是臨床發病率高、且有地域性差異的惡性腫瘤，廣東中西部地區是疾病的高發地區[11-13]。大量流行病學調查結果表明，該疾病其早期癥狀不明顯，發現確診時已是晚期，且伴有淋巴系統的轉移。目前臨床上，該疾病的治療方式首選為放療。放療可使腫瘤不同程度的縮小，使癌細胞活力下降，使癌細胞增殖能力降低，從而控制疾病的發展，從而提高患者的生存率。但鼻咽癌放療扔存在許多毒副作用，最典型的有口腔黏膜反應、骨髓功能抑制等等。因此，有學者提出，同步放療、化療可減少癌癥的遠處轉移，減輕腫瘤組織負荷，改善局部血液循環，增加放射敏感度，從而提高治療效果，延長患者壽命[14-16]。

本研究結果顯示，兩組患者治療前后CNE細胞生長抑制率、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達含量、CD80和CD86陽性率差異顯著，并且隨著時間遷移，CNE細胞生長抑制率、Bax、Caspase-3 mRNA表達含量呈現顯著上升趨勢，Bcl-2表達含量、CD80和CD86陽性率也呈現顯著下降趨勢[17-18]。說明鼻咽癌患者采取針對性的同步放療治療方法，可以有效控制鼻咽癌患者腫瘤細胞的增殖，可能與同步放療可以影響細胞信號轉導通路、細胞周期，從而有效的誘導癌細胞的凋亡有關。

同時，治療4周和治療8周后比較實驗組CNE細胞生長抑制率、Bax、Caspase-3 mRNA表達含量顯著高于對照組。熟地黃被稱為“壯水之主，補血之君”，是優良的補益延壽中藥，具有滋陰補血、填精益髓的功效。熟地黃多糖(Rehmannnia glutinosa polysaccharide，RGP)作為熟地黃的有效成分之一，具有多方面藥理作用，增強機體的造血功能、降血壓、降血糖、抗氧化等[19]。有學者提出，熟地黃多糖對人體多個細胞凋亡的信號通路具有一定藥理作用，而細胞凋亡的信號通路中的線粒體凋亡途徑通常依賴Caspases家族的活化。比如本研究中的Caspase-3、Bcl-2蛋白對細胞凋亡過程的調控至關重要[20]。

研究還發現，實驗組患者CD80和CD86陽性率顯著低于對照組，細胞免疫在腫瘤免疫及其治療過程中發揮非常重要的作用。其中CD80、CD86 均是T淋巴細胞的共刺激分子，CD80與其配體CD28 結合可誘導T 淋巴細胞的活化和增殖。還有研究指出，CD 86可以參與到初次B淋巴的細胞應答過程，具有信號的傳導作用。綜上，熟地黃多糖聯合同步放療對鼻咽癌患者癌細胞的增殖、轉移具有明顯的抑制作用，該聯合治療方式可以為抗鼻咽癌中成藥的開發提供理論基礎。