蟾毒靈通過調控Livin蛋白誘導卵巢癌細胞凋亡的實驗研究

王 博，邵美麗

西北婦女兒童醫院婦產科(西安710061)

主題詞 卵巢腫瘤 細胞凋亡 @蟾毒靈 @Livin蛋白

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，由于其早期的發病癥狀不明顯，難以提前發現和治療，導致卵巢癌病死率一直處于婦科腫瘤的首位。卵巢癌的病因不明，除了手術治療外，卵巢癌的患者多采用化療[1]。化療雖然能有效減少腫瘤細胞的繁殖和侵襲，但同時給機體帶來了嚴重的副作用及不良反應。另外，中晚期卵巢癌化療后易復發，且具有耐藥性。因此尋找一種高效能，少副作用的藥物一直是近年來的研究熱點。蟾毒靈是一種蟾蜍科動物耳后腺及背部皮膚腺分泌物提取的中藥單體，具有解熱鎮痛、抗炎、強心等多種活性，同時蟾毒靈在抗癌方面也有著巨大作用。研究表明，蟾毒靈能有效抑制多種癌細胞的增殖，有著很好的抗癌作用[2-3]。然而其對卵巢癌細胞是否同樣有抗癌作用尚不完全清楚。本實驗以卵巢癌OVCAR-3細胞為實驗對象，探究蟾毒靈對OVCAR-3細胞活力和凋亡的影響，并初步探討其中的分子機制。

材料與方法

1 材 料 ①細胞株：本研究采用人卵巢癌OVCAR-3細胞株，該細胞株由西安交通大學第二附屬醫院婦產科贈予。②藥物和試劑：蟾毒靈購買自美國Sigma公司(貨號B0261)，溶解于DMSO中，配置成1 nmol/L，冷凍放置。用含血清的DMEM培養液進行梯度稀釋至實驗濃度。CCK-8試劑盒用于檢測細胞活力，購買自上海源茲生物科技有限公司。細胞培養主要試劑包括DMEM培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(四季青公司)和抗生素(碧云天公司)等。實驗中Western blot所用試劑和抗體均購買自CST公司。

2 實驗方法 ①細胞培養：人卵巢癌OVCAR-3細胞用高糖DMEM培養基培養，其中加入10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素，細胞孵箱的參數設置為37 ℃，二氧化碳濃度為5%。每隔兩天換一次液。②CCK-8試劑盒檢測細胞生長活力：取干凈的96孔板，超凈臺下將對數期生長的OVCAR-3細胞種植于96孔板中，每孔種植3000個細胞，待細胞貼壁后，分別加入濃度為0、0.1、1、10、100、500 nmol/L的蟾毒靈，每組設置5個復孔。繼續作用24、48 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，1 h后用酶標儀進行吸光度檢測，波長450 nm。以0 nmol/L作為比照值，通過相應數值計算回歸方程，并根據方程求得IC50。③流式細胞技術檢測細胞凋亡：取對數生長期的OVCAR-3細胞，種植于6孔板中，每孔細胞數2×105/ml，培養12 h后，加入不同濃度(0、1、10、100 nmol/L)的蟾毒靈，待刺激時間達到24 h收集細胞。按照流式細胞正規操作流程，加入Annexin-V和PI，尼龍網過濾后上機檢測細胞凋亡情況。④Western blot法檢測蛋白表達：細胞刺激過程與流式檢測中相同，之后收集細胞，利用試劑盒進行蛋白提取。定量后，煮沸10 min，加入12% SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離系統。電泳結束后，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜。5%的BSA稀釋一抗，孵育Livin(1∶400)，β-actin(1∶5000)和Caspase-3(1∶400)一抗，4℃過夜。清洗膜多次后，孵育二抗1 h。加入顯影試劑后，ECL系統顯影成像。使用軟件進行灰度分析，β-actin作為內參。

結 果

1 蟾毒靈對OVCAR-3細胞活力的影響 結果顯示，蟾毒靈處理OVCAR-3細胞24 h和48 h后能明顯降低其細胞活力，并且呈劑量依賴性。10 nmol/L蟾毒靈作用24 h后即可降低OVCAR-3細胞活力，并且隨著時間或者劑量的增加，對OVCAR-3細胞活力的抑制能力越明顯，與未處理的OVCAR-3細胞相比，100 nmol/L蟾毒靈作用24 h的OVCAR-3細胞活力約為對照組的59%。通過構建回歸方程，計算出蟾毒靈作用OVCAR-3細胞24 h和48 h后的IC50為(114.6±4.1)nmol/L和(93.2±3.2) nmol/L(圖1)。

A：蟾毒靈刺激24 h后的細胞活力；B：蟾毒靈刺激48 h后的細胞活力

2 流式細胞計數分析蟾毒靈對OVCAR-3細胞凋亡的影響 通過流式分析技術，檢測蟾毒靈對OVCAR-3細胞凋亡的影響。結果顯示，蟾毒靈能顯著增加OVCAR-3細胞的凋亡水平，并且呈劑量依賴效應，10 nmol/L蟾毒靈即可顯著增加OVCAR-3的凋亡比例，與對照組相比，1、10、100 nmol/L蟾毒靈引起的細胞凋亡百分比為(7.6±1.1)、(17.3±4.3)、(29.8±7.2)(P<0.05)(圖2)。

A：流式細胞結果；B：流式結果分析結果

3 Western blot檢測Livin和Caspase-3的蛋白表達情況 通過檢測Livin和Caspase-3的蛋白表達情況，結果發現，蟾毒靈能顯著增加Caspase-3的剪切，并降低Livin的表達。與對照組相比，1 nmol/L和10 nmol/L即可增加Caspase-3的剪切水平，100 nmol/L蟾毒靈作用24 h后Cleaved Caspase-3的表達水平是對照組的(2.2±0.2)倍(P<0.05)。Livin的Western blot結果顯示，100 nmol/L的蟾毒靈能顯著降低Livin的表達水平，與對照組相比，降低至對照組的(0.4±0.1)倍(P<0.05)(圖3)。

A：凋亡蛋白條帶；B：灰度分析分析結果

討 論

隨著近年來醫療水平的不斷發展，人民預防意識的不斷提高，越來越多的癌癥能夠早期發現，并得到有效治療[4]。然而，卵巢癌，尤其是上皮癌，由于其癥狀非常不典型，并且病因尚不明確，導致目前采取的預防措施均不能有效提高卵巢癌的早期發現，導致發現時卵巢癌多處于中晚期，治療效果也相對有限，因此卵巢癌的治療也成為了研究的重點[5]。化療雖然能有效減少腫瘤細胞的增殖，但是會給病人帶來極大的身體負擔，并且卵巢癌的高復發性和耐藥性，也增加了治療的風險。

近年來，我國科研工作者通過分析多種傳統中藥的成分，成功分離出了一些具有顯著抗癌作用中藥產物，蟾毒靈就是其中一個[6]。蟾毒靈是從傳統中藥蟾酥中提取出來的，其作用廣泛，低劑量的蟾毒靈具有強心，止痛和抗炎的作用，而高劑量的蟾毒靈具有明顯的抗癌作用[7-8]。之前的研究顯示，蟾毒靈對肝癌，膀胱癌和宮頸癌等都有顯著的抑制作用[9-10]。我們的結果顯示蟾毒靈能有效抑制人卵巢癌OVCAR-3細胞的細胞活力，該結果提示，蟾毒靈在治療人卵巢癌中也會發揮明顯的抗癌作用。

為明確蟾毒靈抑制人卵巢癌的細胞活力的原因，我們通過流式細胞技術分析了，不同濃度蟾毒靈對OVCAR-3細胞的凋亡影響。結果顯示隨著劑量的增加，蟾毒靈作用后能明顯促進卵巢癌細胞的凋亡水平，結果提示蟾毒靈對OVCAR-3細胞的抑制作用可能是通過促進其凋亡而發揮作用的。暴蕾等[11]在2014年發表的文章中，發現蟾毒靈對卵巢癌SKOV-3細胞的抑制作用也是通過促進凋亡水平，該結論與我們的研究結果相一致。

Livin蛋白，是近年來發現的新的凋亡抑制蛋白，也被稱為BIRC7蛋白，其結構上又有一個桿狀病毒凋亡抑制蛋重復序列(Baculovirus IAP repeat，BIR)和RING指環結構[12]。一般情況下，Livin在體內表達量很低，但是當在某些腫瘤中，例如肺癌、前列腺癌和卵巢癌，Livin的表達量明顯升高[13]。焦伊勝[14]發現Livin在卵巢癌的發生發展中發揮重要作用，調控Livin可能是治療卵巢癌的靶點之一。為了確證Livin是否參與了蟾毒靈促進卵巢癌的凋亡作用，我們檢測了加入蟾毒靈后Livin和Caspase-3的表達情況，結果提示蟾毒靈能夠顯著抑制OVCAR-3細胞中Livin的表達，并促進Caspase-3的剪切。以上結果提示，蟾毒靈抑制卵巢癌細胞的細胞活力，促進癌細胞的凋亡增加，而這一過程可能受到Livin蛋白的調控。