不同缺氧復氧損傷程度對H9c2心肌細胞自噬的影響

黃小玲 唐軼洋 鐘敏 趙高峰

廣州中醫藥大學第二附屬醫院麻醉科（廣州 510006）

自噬是真核細胞所特有的通過溶酶體降解細胞內物質成分、清除衰老或受損細胞器的過程，對維持細胞內穩態至關重要。目前普遍認為自噬是一種防御和應激調控機制。研究表明心肌缺血再灌注損傷與自噬關系密切，自噬是缺血再灌注損傷心肌細胞死亡的另一途徑［1］。2017年5-10月本研究采用H9c2大鼠心肌細胞作為受試細胞，檢測不同缺氧復氧損傷程度對自噬的影響，并觀察在此種自噬改變下對心肌細胞存活率的影響，從而摸索出當前實驗條件下研究H9c2心肌細胞自噬的最佳缺氧復氧模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H9c2大鼠心肌細胞株購自中南大學湘雅中心實驗室；高糖型DMEM、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、PBS購自美國Gibco公司；四氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、丹酰戊二胺（MDC）購自美國Sigma公司；無糖培養基購自吉諾生物公司；總RNA提取試劑盒購自Promega公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Mas?ter Mix購自Toyobo公司；Atg5、GAPDH引物由廣州艾基生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與模型制備 H9c2心肌細胞在含10%胎牛血清、1%雙抗（v/v）（100 U/mL青霉和100 mg/L鏈霉素）、高糖DMEM培養基，5%CO2、95%空氣的37℃細胞培養箱中培養，每2天更換1次培養基。細胞融合度＞80%時進行傳代，傳代細胞可用于實驗。

取對數生長H9c2大鼠心肌細胞，將細胞隨機分為4組：空白對照組（CON），細胞未作任何處理；缺氧復氧（H/R）模型3組，將H9c2心肌細胞置于37 ℃含 1%O2、5%CO2、94%N2缺氧培養箱中分別以 0.5%FBS 復合高糖 DMEM［2］、無糖培養基［3］、PBS［4］為缺氧液培養3 h模擬不同程度缺血缺氧，然后置換完全培養基置于正常培養箱中培養3 h模擬復氧再灌注。收集復氧后H9c2心肌細胞或用于檢測。

1.2.2 MTT法檢測H9c2細胞存活率 采用對數生長期的心肌細胞，胰酶消化后用完全培養基調成單細胞懸液，分配至96孔板，每孔約100 μL（2×104個/孔）。按上述方法進行分組，每組設5個復孔，并設置調零孔。按上述分組處理后，每孔加入MTT工作液（5 g/L）約10 μL，置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養4 h后吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO終止反應，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀490 nm波長下測定吸光度OD值。實驗重復3次，記錄并計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組OD值-調零孔OD值）/（對照組OD值-調零孔OD值）×100%。

1.2.3 MDC熒光染色流式細胞儀檢測H9c2細胞自噬率 采用對數生長期的心肌細胞，胰酶消化后用完全培養基調成單細胞懸液，分配至24孔板，每孔約500 μL（1 × 105個/孔）。按上述方法進行分組，每組設6個復孔。按上述分組處理后吸除培養基，每孔加入MDC工作液（50 μmol/L）約500 μL，37℃避光孵育20 min，PBS洗3遍后收集細胞，流式細胞儀檢測其熒光強度。由于MDC的激發光為355與染料DAPI相近，故使用DAPI模式檢測各組細胞群集中象限的熒光強度。記錄數據并計算細胞自噬率：自噬率=實驗組熒光強度/對照組熒光強度×100%。

1.2.4 實時熒光定量PCR法檢測細胞內Atg5 mRNA的表達 采用總RNA提取試劑盒按照試劑盒說明提取細胞總RNA，檢測其濃度與純度。逆轉錄試劑盒合成單鏈cDNA，以cDNA為模板，SYBR Green摻入法進行PCR反應擴增。ATG5引物上游序列 5′?TGGACGGATTCCAACGTGCTTTAC?3′，下游序列 5′?TTTGTCAGTTACCAGCGTCAAATAGC?3′，內參GAPDH引物上游序列5′?AGTGCCAGCCT?CGTCTCATA?3′，下游序列5′?ACCAGCTTCCCATT?CTCAGC?3′。反應體系25 μL：含SYBR Green Master 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2.5 μL，ddH2O 9 μL。每組設2個復孔。反應條件如下：95℃3 min、95 ℃ 15 s、58℃ 15 s、72℃ 15 s共39個循環。應用Rio?Rad CFX Manager軟件分析每個孔Atg5及GAPDH的熒光強度并計算Atg5 mRNA表達的相對量。每組實驗至少重復2次。

1.3 統計學方法 利用Stata 13統計軟件包處理數據。數據用均數±標準差表示，多組之間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H/R對H9c2心肌細胞存活率的影響 與CON組相比，各H/R模型組細胞存活率均降低（P＜0.05），其中0.5%FBS復合高糖DMEM、無糖培養基、PBS處理的各H/R組細胞存活率分別下降了15.2%、19.4%、25.9%。見圖1。對照組細胞存活率取100%。

2.2 各組H9c2心肌細胞自噬率的變化 如圖2A所示，取右下象限細胞群為陽性象限細胞群（P1），根據各組熒光強度統計結果顯示，與CON組相比各H/R模型組心肌細胞自噬率差異有統計學意義（P＜0.05），其中0.5%FBS復合高糖DMEM、無糖培養基處理的H/R心肌細胞自噬率分別增加了26.2%、8.6%，PBS處理的則下降了17.5%。見圖2B。對照組細胞自噬率取100%。

圖1 MTT法檢測各組H9c2心肌細胞存活率Fig.1 The survival rate of H9c2 cardiomyocytes determined by MTT method

圖2 流式細胞儀檢測各組H9c2心肌細胞自噬率Fig.2 The autophagy rate of H9c2 cardiomyocytes determined by flow cytometer

2.3 Atg5 mRNA的表達 實時熒光定量PCR的結果顯示，與對照組相比各H/R模型組心肌細胞Atg5 mRNA的表達差異有統計學意義（P＜0.05），其中0.5%FBS復合高糖DMEM、無糖培養基處理的H/R心肌細胞Atg5 mRNA的表達分別增加了49%、10.5%，PBS處理的則下降了15.1%。見圖3。對照組細胞Atg5 mRNA的表達取100%。

圖3 實時熒光定量PCR法檢測各組H9c2心肌細胞Atg5 mRNA的表達Fig.3 The mRNA expression levels of Atg5 analyzed by RT?PCR

3 討論

缺血性心臟病是心血管系統中發病率及病死率較高的疾病，臨床上多開展冠脈搭橋、冠狀動脈介入術等進行治療，但恢復冠脈血流灌注后，常引發H/R損傷［5］。因此，如何有效保護缺血心肌細胞，減輕H/R損傷是目前研究的重點。研究發現自噬在一些嚴重的心臟病理狀況下，包括心肌梗死、缺血再灌注損傷及心力衰竭中發揮至關重要的作用［6］，缺血性心臟病的發生發展及致死率與心肌細胞自噬的改變有很大的相關性［7］。自噬在心臟疾病中到底扮演著怎樣的角色，取決于細胞自噬發生的水平及病理狀態［8-10］。通過離體心臟研究發現自噬在缺血期處于較低水平，再灌注期則被高度激活，使用經典的抑制劑3-MA后，自噬水平降低，再灌注后心肌梗死面積減少，提示心肌細胞自噬水平與心肌缺血再灌注損傷的程度呈正相關［11］。

研究表明，H9c2細胞株來自大鼠胚胎的心肌細胞，雖然不能搏動，但因為具有與原代培養乳鼠心肌細胞相似的功能與特性，且易于分離培養并可傳代，在H/R實驗中具有廣闊的應用前景。故本研究選用H9c2大鼠心肌細胞株作為研究對象。體外心肌細胞H/R模型一直被廣泛應用于H/R損傷的研究，對于探討H/R損傷的分子機制具有重要的意義。但國內外利用缺氧箱建立H/R細胞模型的條件并沒有統一的標準。根據查閱的文獻，目前構建H/R損傷模型時常常采用斷氧及斷糖兩種方式，使用低血清或無血清缺氧液并置于缺氧箱中培養模擬心肌細胞缺血缺氧環境，通過恢復血清和氧的供應模擬再灌注。對于缺氧培養時的氧濃度主張從無氧到5%各有不同［12-13］，缺氧復氧的時間和缺氧液也各有不同，常用的缺氧液有自配缺氧液［14］、無血清無糖培養液［3］、無糖Hanks液［15］等。本實驗選用1%的氧濃度，分別以0.5%FBS復合高糖DMEM、無糖培養基和PBS為缺氧液缺氧3 h后復氧3 h來模擬H/R，實驗結果發現各缺氧液處理的H/R模型組心肌細胞存活率均低于正常對照組（P＜0.05），表明上述方法建立的離體細胞H/R損傷模型是可行的，利用缺氧培養箱可以造成H9c2心肌細胞H/R損傷。

多數研究者認為H/R發生的基礎是能量代謝障礙［16］。從營養物質及能量供給方面考慮，0.5%FBS復合高糖DMEM優于無糖培養基，無糖培養基優于PBS。本研究結果表明三者作為缺氧液H/R損傷后細胞存活率逐漸下降，說明損傷的程度與其缺氧液物質和能量供給的優劣是相一致的；心肌細胞自噬率以及Atg5 mRNA的表達也逐漸下降，說明細胞自噬的水平也有可能和物質與能量的需求平衡相關。LUM等［17］研究認為，各種原因引起的細胞內ATP水平的下降均可誘發自噬，從而保證細胞能量代謝的穩定，利于細胞生存，但是過于嚴重或時間過長的“饑餓”狀態反而抑制自噬。本研究的結果與上述的研究結論是一致的。0.5%FBS復合高糖DMEM、無糖培養基處理的心肌細胞自噬率以及Atg5 mRNA的表達相對對照組是增加的，這表明以上兩種缺氧液H/R損傷后誘發自噬，且前者更明顯；而PBS處理的相對對照組則是下降的，表明PBS作為缺氧液H/R損傷后反而抑制自噬。這說明H/R損傷心肌細胞自噬的水平可能與心肌缺氧的程度以及細胞的狀態呈相關性，但尚需要進一步的實驗進行證實。

綜上，利用缺氧培養箱可以造成H9c2大鼠心肌細胞缺氧復氧損傷，缺氧復氧損傷心肌細胞自噬的水平與心肌缺氧的程度以及細胞的狀態呈相關性。細胞適度缺氧復氧可以激活細胞自噬，但細胞過分缺氧反而抑制自噬。