山藥花青素合成關鍵酶基因的解析

殷劍美,王 立,張培通,韓曉勇

(江蘇省農業科學院 經濟作物研究所,江蘇 南京 210014)

花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,它不僅可以使花朵和果實呈現鮮艷的顏色而具有觀賞價值,有利于吸引昆蟲和食草動物協助傳粉和種子傳播,還有助于提高抗逆性,如抵御低溫和紫外線傷害,以及防治植物病害[1-2],同時還是迄今為止發現的最強效的自由基清除劑,具有抗氧化衰老、抗突變、抗癌與抗動脈硬化等功能,對人體有保健功能[3-4]。

花青素是植物次生代謝的重要產物之一,其生物合成涉及多個酶,如苯丙氨酸裂解酶(PAL)、黃烷酮3-羥基化酶(F3H)、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)和黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶(UFGT),而這些酶各自因物種不同而成為主導花青素形成的關鍵酶。研究表明,F3H、DFR、ANS和UFGT分別是金魚草、矮牽牛、石竹和葡萄的關鍵酶基因[5-6]。目前大多數的研究集中在地上器官和組織中花青素方面,而對地下器官花青素的研究較少。

山藥作為藥食兩用的植物,其營養價值、藥用價值及抗病機理正逐步被發現和證實,并愈來愈受到廣大消費者的青睞,具有十分廣闊的市場前景[7]。紫山藥(DioscoreaalataL.)是天然紫色山藥品種,富含花青素,在南非和中國南部的栽培面積很廣[8]；紫山藥皮可作為提取紫色素的來源[9]；作為一種新型的天然色素資源,紫山藥在食品、化妝品及醫藥等行業中也將具有廣闊的應用前景。因此對山藥花青素的研究不僅具有重要的理論意義,還具有較好的實用價值。

我們在前人研究的基礎上,以紫肉山藥和白肉山藥為試驗材料,分析了花青素合成基因在兩者之間的表達差異,以期找出紫山藥花青素合成的關鍵基因,為進一步研究紫山藥花青素合成途徑中各個基因的調控機理提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

供試材料為紫山藥品種“Yzi006”(紫肉)和白山藥品種“Ybai002”(白肉)。于2013年4月2日將它們種植于江蘇省農業科學院(南京)實驗基地,于4月26日出苗。在出苗后第50天分別取幼葉、成熟葉、幼莖和成熟莖；于出苗后第50、65、80天(塊莖膨大初期)，第95、110、125天(塊莖膨大盛期)，第140、155、170天(塊莖膨大后期)，以及第185天(塊莖膨大末期)分別取地下塊莖,所取樣品用液氮速凍后,保存于-70 ℃備用；每份樣品均取樣3次，作為重復。山藥生育期的劃分參考黃文華[10]和殷劍美等[11]的方法。

1.2 克隆及測序

RNA提取和cDNA第一條鏈的合成參照Valderrama-Cháirez等[12]的方法(本文略加改進)。

根據NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中Actin-2、PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT基因序列在山藥基因組EST數據庫中的比對結果,用Primer 5軟件設計PCR引物(表1),進行擴增。PCR反應條件為:94 ℃預變性10 min；94 ℃ 40 s,56 ℃ 40 s,72 ℃ 90 s,32個循環；72 ℃延伸10 min。引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。PCR擴增產物用凝膠回收試劑盒回收,與pMD18-T載體在16 ℃下連接過夜,通過DH5α轉化克隆,挑選陽性克隆菌液送交南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.3 實時熒光定量PCR

在NCBI中,使用Blastn軟件進行序列比對,在確定目的片段為山藥中相關基因的核苷酸序列片段后,用Beacon Designer 7軟件分別設計了各基因的熒光定量PCR引物(表1)。對不同組織中各個基因的實時定量檢測分析在ABI7500 Real Time PCR儀(由美國應用生物系統公司生產)上完成。

1.4 花青素含量的測定

花青素含量的測定參考Merthens[13]的方法。將0.1 g新鮮組織材料切碎，加入6 mL提取液(濃鹽酸∶80%乙醇=1∶99, v/v)浸提10 h。花青素含量的計算公式為:Q=(A530-0.25×A657)/FW,式中Q為花青素相對含量；FW為樣品鮮重(g)。

花青素相對積累量的計算公式為:An=Qn×FMn,式中：An為花青素相對積累量；n為樣品取樣時間；Qn為花青素含量；FMn為1株的塊莖鮮重(g)。花青素積累速率的計算公式為:R=(An-An-1)/D,式中D為2次取樣的間隔天數[14]。

2 結果與分析

2.1 Yzi006和Ybai002不同組織器官中花青素含量的比較

Yzi006的幼葉、莖和塊莖均呈紫色,成熟葉為綠色；Ybai002的幼葉、成熟葉和莖均為綠色,塊莖為白色(圖1A)。對以上組織器官中的花青素含量分別進行測定，從圖1B可以看出： Yzi006幼葉和早期塊莖中的花青素含量明顯高于成熟葉和后期塊莖中的,而莖中花青素含量變化不明顯,且葉片、莖和塊莖中花青素的含量均隨著生長發育的推進而逐漸下降； Ybai002各個組織器官中花青素含量很低且基本保持不變。

a:紫山藥幼葉; b:紫山藥成熟葉; c:白山藥幼葉; d:白山藥成熟葉; e:紫山藥莖; f:白山藥莖; g:紫山藥塊莖; h:白山藥塊莖。

2.2 Yzi006和Ybai002不同組織器官中花青素合成基因的表達水平

對山藥葉、莖及不同生長期塊莖中花青素合成基因PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT的表達水平進行了分析，結果如圖2所示。除了DFR基因外,其他基因在山藥幼嫩組織中的表達水平更高。PAL在Yzi006葉、莖和塊莖中的表達水平高于Ybai002相應組織器官中的,并且在莖中的表達水平遠遠高于在葉中的表達水平。F3H在葉和莖中的表達水平相同,但是在Yzi006塊莖中的表達水平要高于在Ybai002塊莖中的表達水平。值得注意的是,DFR在成熟葉中的表達水平要遠遠高于在幼葉和莖中的表達水平,且該基因在Yzi006塊莖中的表達水平高于在Ybai002塊莖中的表達水平。ANS和UFGT在葉、莖和塊莖中的表達趨勢相同,均在Yzi006幼葉和塊莖膨大早期高度表達,而在Ybai002對應組織器官和其他組織器官中的表達水平很低。總之,PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT在Yzi006塊莖中的表達水平較高。

2.3 Yzi006塊莖中花青素的積累

由圖3可見： Yzi006塊莖從開始形成時,塊莖鮮重就一直持續增加,塊莖中花青素的積累有兩個高峰期,中間有一個緩慢增長期,呈一個典型的雙“S”增長曲線。具體而言：第一個快速積累期在塊莖膨大盛期,此時花青素含量達到最高；第二個快速積累期在塊莖膨大后期,此時塊莖鮮重增加速度最高；花青素含量在塊莖膨大初期開始下降,在塊莖膨大盛期有所回升,并且花青素積累量迅速升高；進入塊莖膨大后期后,塊莖重量快速增加,花青素含量持續下降,導致花青素進入緩慢積累階段;到達塊莖膨大末期時,塊莖停止生長,花青素含量略有回升,花青素積累量趨于最高。

2.4 Yzi006塊莖中花青素積累量、積累速率與花青素合成相關基因表達水平間的關系

對紫山藥塊莖中花青素積累量、積累速率和花青素合成相關基因的表達水平進行綜合分析(表2),發現各個基因的表達水平與花青素積累速率存在協同性。PAL、F3H、DFR、ANS、UFGT在第50～110天內極顯著性高度表達的同時,紫山藥塊莖中花青素積累速率快速升高,在第125天積累速度達到最大值31.37/(株·d),存在極顯著性差異；當ANS、UFGT基因表達水平分別在第125、140、155天顯著性回升后,花青素積累速率再次顯著性升高,在第155天達到第2個高峰,積累速率最快為15.87/(株·d)。由此可見,花青素合成基因PAL、DFR、ANS、UFGT的表達水平均與紫山藥塊莖中花青素積累存在明顯的相關性。

3 討論

由于花青素通常貯藏于花、葉、莖等器官中,所以,在蛋白質和基因水平上研究花青素合成酶及其相關基因的報道多出自這些器官,而對植物地下器官尤其是塊莖中花青素合成酶及其相關基因的研究還不多。薯芋塊莖類植物花青素生物合成的調控方式與植物花、果實等地上器官中的情形很可能不同,有可能存在一種全新的花青素合成與調控機制,因此對山藥花青素合成代謝的相關研究,不僅對進一步明確花青素合成調控機理具有重要意義,對于嚴重缺乏科研資料背景的山藥作物本身更是意義非凡。

“*”和“**”分別表示差異達顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

圖3 Yzi006塊莖重量、塊莖中花青素含量和積累量的變化

由于木質素和莖木質化的原因,PAL在甘蔗幼莖中的表達量要遠遠高于葉中的表達量,且PAL在莖中的表達水平與莖的發育速度呈正相關,因此Kolahi等推測PAL對甘蔗莖的木質化具有重要作用[15]。本研究也發現PAL在山藥莖中的表達水平要高于葉中的。Sun等[16]發現F3H在紅色花系和白色花系的瓜葉菊中均有表達,因此指出F3H不是瓜葉菊花青素合成途徑中的關鍵基因。這與本研究中F3H在紫山藥和白山藥中的表達情況相同。因此,PAL和F3H的表達水平對紫山藥塊莖中花青素含量和積累量雖具有相關性,但這2個基因不是調控紫山藥花青素合成的關鍵點。

表2 紫山藥塊莖發育過程中花青素積累速率與相關基因表達水平間的關系

注：同列數據后附“*”代表P<0.05,差異顯著;“**”代表P<0.01,差異極顯著。

DFR不僅參與花青素的合成,同時也產生縮合單寧的誘導性底物[17]。Liu等[18]檢測到高粱中SbDFR1基因參與了合成花青素,SbDFR3基因合成3-脫氧花青素起到植物脅迫反向的補償作用[19]; Cheng等[20]成功克隆了島銀杏中DFR基因的3個拷貝,并發現GbDFR1和GbDFR2的主要作用是參與植物防護機制,抵御傷害、脅迫以及外源激素的刺激,而GbDFR3的職責主要是合成花青素。在本研究中，DFR基因在功能葉中的表達水平比在幼葉和莖中高,并且在白山藥中的表達水平高于紫山藥中的,有可能是因為白山藥葉片中需要DFR合成更多的縮合單寧來抵御UV-B以及蟲害等傷害。

周生茂等[21]從田薯地下塊莖中分離到1個ANS基因(DaANS1),并發現其表達模式與ANS酶活性和花青素含量在塊莖中的變化具有協同性；而Afifi等[22]和Piero等[23]分別報道在葡萄藤和甜橙中UFGT與花青素的合成具有重要關聯性,而ANS與花青素合成的關聯性不大。本研究發現,ANS和UFGT均在紫山藥幼葉及塊莖形成早期高度表達,而在白山藥中低表達或不表達,推測ANS和UFGT可能是導致紫山藥和白山藥顏色差異的關鍵基因。

Yzi006塊莖中花青素的積累速率存在兩個高峰值,第一個較高的峰值出現在塊莖膨大盛期,第二個較低的峰值出現在塊莖膨大后期；PAL和F3H基因的表達水平只在塊莖膨大初期最高,DFR從塊莖膨大初期開始到盛期結束一直持續較高的表達水平,ANS和UFGT在塊莖膨大初期的表達水平最高,之后下降,而在塊莖膨大盛期和第二個花青素積累速率達到高峰前再次上升,推測DFR、ANS和UFGT對塊莖膨大初期和后期花青素的積累具有重要作用,而PAL和F3H只對塊莖膨大初期花青素的積累具有影響。綜上所述,推測紫山藥花青素合成的關鍵基因可能是ANS和UFGT或是兩者之一,其表達模式還需進一步研究。