miR-548c表達在子宮內膜癌和卵巢癌細胞侵襲和遷移中的作用

孫小淳，李析蒨，趙 坤，張愛臣*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033;2.琿春市人民醫院)

侵襲性生長和遠處轉移是腫瘤惡性化進程的主要特征，涉及到一系列基因表達改變以及信號通路的影響[1,2]。研究表明，miRNA在惡性腫瘤中的表達水平高低與其具有促癌或抑癌作用有關[3,4]。miR-548c屬于miRNA家族成員，在之前的研究中我們已發現miR-548c在子宮內膜癌以及卵巢癌組織中的表達水平異常下調，且miR-548c表達下調與子宮內膜癌患者的不良預后有關，miR-548c在子宮內膜癌和卵巢癌的發生和發展中可能具有抑癌基因的作用。為了明確miR-548c在子宮內膜癌以及卵巢癌發生、發展中的具體作用機制，本研究通過分別上調和下調miR-548c在子宮內膜癌以及卵巢癌細胞系中的表達，檢測miR-548c表達變化后對上述細胞生物學行為的影響，旨在為了解miR-548c對子宮內膜癌以及卵巢癌惡性化生長的影響，從而為探索miR-548c在子宮內膜癌以及卵巢癌發生和發展中的作用機制提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1細胞系

本研究所采用的人子宮內膜癌細胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細胞系(SKOV-3和OVCAR3)均購自中國科學院典型培養物保藏中心上海細胞庫，對子宮內膜癌細胞系和卵巢癌細胞系的細胞行細胞復蘇、細胞傳代和細胞凍存。

1.2miR-548cmimic和miR-548cinhibitor抑制劑

miR-548c mimic(40 nM)、miR-548c inhibitor(40 nM)及其相應陰性對照均購自美國Ambion公司。Bulge-Loop miRNA qRT-PCR檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司，Trizol總RNA提取試劑盒DMEM細胞培養基購自Gibco公司。

1.3子宮內膜癌和卵巢癌細胞系中miR-548c表達檢測

采用熒光定量PCR分別檢測人子宮內膜癌細胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表達。

1.4實驗分組

RL95-2細胞，Anti-Ctr組：將miRNA inhibitor control轉染RL95-2細胞；Anti-548c組：將miR-548c inhibitor轉染RL95-2細胞。OVCAR3細胞，Anti-Ctr組：將miRNA inhibitor control轉染OVCAR3細胞；Anti-548c組：將miR-548c inhibitor轉染OVCAR3細胞。HEC-1細胞，Pre-Ctr：將miRNA mimic control轉染HEC-1細胞；Pre-548c：將miR-548c mimic轉染HEC-1細胞。SKOV-3細胞，Pre-Ctr：將miRNA mimic control轉染SKOV-3細胞；Pre-548c：將miR-548c mimic轉染SKOV-3細胞。

1.5細胞轉染

將處于對數生長期的細胞的培養液棄盡，向瓶內加入無抗生素的DMEM細胞培養液，隨后繼續培養24 h；用移液器吸取50 μl無血清無抗生素的DMEM細胞培養基，分別吸取20 pmol miR-548c mimic/miR-548c inhibitor質粒及其陰性對照miRNA mimic control/miRNA inhibitor control質粒加入到培養基內；向一支新的無菌離心管內加入50 μl無FBS無抗生素的DMEM細胞培養基，將1 μl 2 000加入至上述離心管內，用微量移液器輕柔混勻，于超凈工作臺中靜置5 min；隨后用微量移液器將兩者輕柔混勻，于超凈工作臺上靜置20 min；倒掉細胞培養板內原有的培養基，分別將無抗生素和FBS的DMEM培養基加入至各細胞培養孔內，將獲得的轉染試劑分別加入至相應的細胞孔中，將細胞版放置于培養箱中4-6 h，然后倒掉瓶內的培養液，更換為含有10% FBS的DMEM細胞培養液，采用熒光定量PCR分別檢測上述各組細胞中miR-548c的表達。

1.6細胞侵襲能力檢測

無基質膠Transwell的制備：①包被基質膜，1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜，隨后將之放置在4℃環境下風干；②水化基底膜，用移液器將細胞培養板中殘留的液體吸出，向每孔細胞內加入50 μl含有10 g/L 的DMEM無血清培養基，隨后將該培養板放置于37℃培養箱內30 min；取1體積預冷的Transwell膠和8體積無血清DMEM細胞培養基，將兩者徹底混勻，把混合后的溶液分別加入Transwell小室底部膜內(50 μL/孔)，隨后將Transwell小室放置在培養箱中直至成膠；棄掉細胞培養上清，將培養液更換為無血清DMEM培養基，隨后繼續培養細胞12-24 h，采用胰蛋白酶消化細胞，PBS清洗1-2次，最后一次離心后將上清棄盡，向管內加入DMEM細胞培養液重懸細胞，分別吸取200 μl上述調整好密度的細胞懸液至于每個Transwell小室的上室中，再分別吸取含有10% FBS的DMEM細胞培養液于每個Transwell小室的下室中；將制好的Transwell小室板繼續培養48 h，隨后將Transwell小室板中的原有培養液棄掉，并用PBS對板內的細胞進行清洗，再對細胞進行固定；然后對細胞進行染色；將染色畢后的Transwell小室板置于顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野對細胞進行計數，對每組細胞設置5個復孔，并重復本實驗3次，求細胞數的平均值。

1.7細胞遷移能力檢測

按照分組要求將相應質粒轉染細胞，隨后繼續培養24 h，棄掉瓶內原有培養液，用無血清培養液清洗細胞2-3次，隨后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用無血清培養液重懸細胞并制成單細胞懸液；向Transwell(8 μm孔徑)下室內加入600 μl含有10% FBS的DMEM細胞培養液，在上室內加入200 μl前一步驟獲得的細胞懸液，放入37℃培養箱內孵育24 h；將上室和下室中的液體棄掉，隨后向下室內加入600 μl 4%多聚甲醛固定細胞，時間為30 min，將多聚甲醛棄掉，用棉簽擦除未穿過膜的細胞；向下室內加入600 μl 0.1%結晶紫溶液進行染色，時間為10 min，用PBS緩沖液清洗Transwell小室，在顯微鏡下觀察細胞并進行計數。

1.8統計學分析

2 結果

2.1子宮內膜癌和卵巢癌細胞系中miR-548c表達檢測

采用熒光定量PCR分別檢測人子宮內膜癌細胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表達。結果顯示(圖1)，在子宮內膜癌細胞系中，RL95-2細胞miR-548c的表達水平明顯高于HEC-1細胞；在卵巢癌細胞系中，OVCAR3細胞miR-548c的表達水平明顯高于SKOV-3細胞。

2.2轉染后各組細胞中miR-548c表達檢測

采用熒光定量PCR分別對轉染后人子宮內膜癌細胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表達情況進行檢測。結果顯示(圖2)，在RL95-2細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯降低(P<0.01)；在OVCAR3細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯降低(P<0.01)；在HEC-1細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯增高(P<0.01)；在SKOV-3細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯增高(P<0.01)。上述研究結果表明，miR-548c表達抑制的RL95-2和OVCAR3細胞系，以及miR-548c表達上調的HEC-1和SKOV-3細胞系構建成功，可用于下一步實驗研究。

2.3細胞侵襲能力檢測

采用Transwell法分別對轉染后人子宮內膜癌細胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細胞系(SKOV-3和OVCAR3)的侵襲能力進行檢測。結果顯示(圖3)，在RL95-2細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞侵襲能力明顯升高(P<0.01)；在OVCAR3細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞侵襲能力顯著上升(P<0.01)；在HEC-1細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞侵襲能力明顯下降(P<0.01)；在SKOV-3細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞侵襲能力明顯降低(P<0.01)。

2.4細胞遷移能力檢測

采用Transwell法分別對轉染后人子宮內膜癌細胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細胞系(SKOV-3和OVCAR3)的遷移能力進行檢測。結果顯示(圖4)，在RL95-2細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞遷移能力明顯升高(P<0.01)；在OVCAR3細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞遷移襲能力顯著上升(P<0.01)；在HEC-1細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞遷移能力明顯下降(P<0.01)；在SKOV-3細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞遷移能力明顯降低(P<0.01)。

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

3 討論

機體內的細胞受到了原癌基因發生活化或者抑癌基因出現異常失活的影響，從而使得細胞的增殖生長及分化發生失控，進而導致細胞轉向癌細胞發展。在惡性腫瘤發生和發展的一系列過程當中，惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移是其最為致命的環節[5,6]。子宮內膜癌和卵巢癌的發生和發展為一個多因素共同參與的多階段級聯反應的復雜過程，依賴于子宮內膜癌和卵巢癌細胞以及促進子宮內膜癌和卵巢癌細胞生長、增殖、侵襲、轉移、血管新生等一系列內環境因素的相互作用。在多種惡性腫瘤組織以及細胞系中均能檢測到miRNA的異常表達，所以miRNA在腫瘤的惡性化進程中扮演著至關重要的角色。miRNA能夠經由調控細胞增殖、凋亡、侵襲以及轉移等影響腫瘤的發生和發展，最終發揮著類似癌基因或者抑癌基因的作用。隨著基因測序和分子生物學技術的發展，越來越多的研究證明miRNA在生殖系統腫瘤的發生、惡性化進展以及耐藥等過程中發揮著重要作用[7-9]。

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

miRNA的表達發生異常改變往往預示著疾病的發生和發展，因此采用人為手段把與疾病進程相關的miRNA表達水平上調或者下調，或者將對于疾病的研究以及相關藥物的研制開發具有十分重要的意義，該領域也是目前腫瘤醫學界研究的熱點和難點。近幾年來研究者們已經相繼發現了多種能夠有效調控miRNA表達的方法，其中包括模擬物、抑制劑、轉基因學以及點突變等。而在上述各種途徑當中，通過轉染模擬物或者加入抑制劑的方法影響目標miRNA的表達最為有效，且操作更為簡單易行，成功率高，所以已經成為現階段疾病和藥物研究領域中應用較為廣泛的實驗方法[10-12]。在之前的研究中我們發現，miR-548c在子宮內膜癌以及卵巢癌組織中的表達水平異常下調，且miR-548c表達下調與子宮內膜癌患者的不良預后有關。上述研究結果提示，miR-548c在子宮內膜癌和卵巢癌的發生和發展中可能具有抑癌基因的作用。為了了解miR-548c在子宮內膜癌和卵巢癌惡性化進程中的具體作用，本研究通過轉染miR-548c模擬物或抑制劑的方法上調或下調子宮內膜癌和卵巢癌細胞系中miR-548c的表達水平，旨在明確miR-548c表達變化后對上述兩種類型細胞生物學行為的影響。為了更好的開展后續研究，我們首先對用于后續實驗的子宮內膜癌和卵巢癌細胞系進行選擇。結果顯示，在子宮內膜癌細胞系中，RL95-2細胞miR-548c的表達水平明顯高于HEC-1細胞；在卵巢癌細胞系中，OVCAR3細胞miR-548c的表達水平明顯高于SKOV-3細胞。因此，本研究選取上述細胞系進行轉染。分別將miR-548c mimic(40 nM)、miR-548c inhibitor(40 nM)及其相應陰性對照轉染篩選出的子宮內膜癌和卵巢癌細胞系，隨后用熒光定量PCR測定轉染后各組細胞中miR-548c的表達情況，用以鑒定轉染是否成功。結果顯示，在RL95-2細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯降低(P<0.01)；在OVCAR3細胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯降低(P<0.01)；在HEC-1細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯增高(P<0.01)；在SKOV-3細胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細胞中miR-548c的表達水平明顯增高(P<0.01)。上述研究結果表明，miR-548c表達抑制的RL95-2和OVCAR3細胞系，以及miR-548c表達上調的HEC-1和SKOV-3細胞系構建成功，可用于下一步實驗研究。

腫瘤侵襲和轉移是造成患者預后不良和復發、死亡率上升的主要原因。miR-548c對肝癌細胞的侵襲和遷移具有抑制作用，那么其是否對子宮內膜癌和卵巢癌的侵襲和遷移也能夠發揮相同的功能？本研究采用Transwell小室法分別檢測了子宮內膜癌細胞和卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力。結果表明，在RL95-2和OVCAR3細胞中，miR-548c表達抑制后細胞的侵襲和遷移能力明顯增高(P<0.01)；而在SKOV-3和HEC-1細胞中，當miR-548c表達上調后細胞的侵襲和遷移能力則顯著降低(P<0.01)。上述研究結果表明，miR-548c對子宮內膜癌和卵巢癌細胞的侵襲和遷移具有抑制作用。

綜上所述，本研究通過體外細胞實驗初步證實miR-548c對子宮內膜癌和卵巢癌細胞的侵襲、遷移具有抑制作用，從而抑制子宮內膜癌和卵巢癌發生和發展。但上述過程中的相關機制尚未探明，因此還需進一步探索研究。