尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達

王麗娟，萬 明，安金剛

(1.中航工業西安醫院 皮膚科，陜西 西安710000;2.西安市北方醫院 皮膚科;3.西安交通大學第二附屬醫院 皮膚科)

尋常型銀屑病作為一種慢性炎癥性皮膚病，以皮膚瘙癢、干燥、紅疹等為主要臨床表現[1]，該病病因復雜，目前發生機制尚未完全清楚，且易復發[2]，給患者生活質量造成嚴重影響。研究表明[3]，角質形成細胞異常增殖分化、炎癥細胞浸潤、免疫功能異常是尋常性銀屑病主要的病理基礎。近年來研究發現[4]，內源性大麻素系統在皮膚正常生理代謝、炎癥反應及炎癥性皮膚病中發揮重要作用。大麻素受體(cannabinoid receptor，CNR)作為一種G蛋白偶聯受體，包括CNR1和CNR2兩個重要亞型，是內源性大麻素系統重要組成，在調控內源性大麻素系統參與的各項生理病理過程中發揮重要作用[5]。本研究為進一步探討CNR在尋常性銀屑病發病中的作用，對患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達進行分析，并探討其在評估疾病嚴重程度中的意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取2015年3月至2017年3月在我院皮膚科門診就診的尋常型銀屑病患者78例，病例納入標準：①所有患者均具有典型的臨床癥狀，符合尋常型銀屑病診斷標準[6]；②本次發病前未進行外用藥物或系統治療；③無免疫系統、結締組織、類風濕關節炎等自身免疫性疾病；④近2月內未使用過免疫抑制劑等影響免疫功能的藥物；⑤排除孕婦及哺乳期婦女。其中，男性43例，女性35例，平均年齡(31.5±6.7)歲，病程5個月-16年，平均(7.6±2.4)年，根據患者病程將患者分為靜止期和進展期，其中，靜止期28例，進展期50例。同期，從體檢中心選取45例健康者作為血清對照組，其中，男性26例，女性19例，平均年齡(32.4±7.0)歲，兩組在性別、年齡無差異(P>0.05)，均衡可比。同時，從手術室選取手術切除的正常皮膚組織40份作為皮膚對照組，均經病理學檢查證實，其中，男性21例，女性19例，平均年齡(30.8±6.4)歲，與尋常型銀屑病患者在性別、年齡無差異(P>0.05)，均衡可比。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有研究對象均行知情同意。

1.1.2主要試劑和設備 CNR1和CNR2檢測試劑盒均購自上海研盟生物工程有限公司，Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄和PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，CNR1、CNR2及內參引物由上海生工生物公司設計合成實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2方法

1.2.1酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)檢測血清中CNR1和CNR2水平 所有尋常型銀屑病患者和血清對照組均采取晨起空腹靜脈血6 ml，4℃下于3 500 r/min離心20 min，留取血清，保存于-70℃以備檢。利用ELISA法檢測血清中CNR1和CNR2水平，所有操作均在標準實驗室按照試劑盒說明完成。

1.2.2實時熒光定量PCR技術檢測組織中CNR1和CNR2基因表達 取尋常型銀屑病患者皮損組織和皮膚對照組正常皮膚組織，研磨后，加入細胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒對組織中總RNA提取并檢測純度和濃度。取50 μg總RNA，逆轉錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。引物序列：CNR1：上游：5’-GAGCAAGGACCTGAGACATGC-3’，下游：5’-CTTAACAGTGCTCTTGATGCAGC-3’；CNR2：上游：5’-GACCGCCATTGACCGATACC-3’，下游：5’-GGACCCACATGATGCCCAG-3’； GAPDH：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’。PCR反應條件：94℃ 3 min，92℃ 30 s，53℃ 30 s，75℃ 30 s，連續循環38次，每個樣品設3個平行反應復孔。用2-△△Ct法計算組織中CNR1和CNR2基因相對表達量。

1.2.3銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI)評分 尋常型銀屑病患者就診時根據皮損面積和皮損嚴重程度對患者進行評分[7]：公式：PASI評分=(E頭+I頭+D頭)×A頭×0.1+(E上肢+I上肢+D上肢)×A上肢×0.2+(E軀干+I軀干+D軀干)×A軀干×0.3+(E下肢+I下肢+D下肢)×A下肢×0.4。其中，A：面積，E：紅斑，I：斑塊肥厚程度，D：鱗屑。

1.3統計學分析

2 結果

2.1尋常型銀屑病患者和血清對照組血清中CNR1和CNR2水平比較

尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 尋常型銀屑病患者和血清對照組血清中CNR1和CNR2水平比較

2.2不同病程尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比較

與血清對照組相比，進展期和靜止期尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均升高，且進展期高于靜止期，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同病程尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比較

注：與血清對照組相比，aP<0.05；與靜止期相比，bP<0.05

2.3尋常型銀屑病患者和皮膚對照組皮膚組織中CNR1和CNR2表達比較

尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均高于皮膚對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 尋常型銀屑病患者和血清對照組血清中CNR1和CNR2水平比較

2.4不同病程尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1和CNR2表達比較

與皮膚對照組相比，進展期和靜止期尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均升高，且進展期高于靜止期，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同病程尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1和CNR2表達比較

注：與皮膚對照組相比，aP<0.05；與靜止期相比，bP<0.05

2.5尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達與PASI評分相關性

Pearson相關分析顯示，尋常型銀屑病患者血清CNR1和CNR2水平均與PASI評分呈正相關(r=0.412、0.435，P<0.05)，皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均與PASI評分呈正相關(r=0.324、0.406，P<0.05)。

3 討論

銀屑病是常見的皮膚慢性炎癥性疾病，與免疫系統功能異常密切相關，且病程遷延反復、尚無特效的治愈方法[8]，尋常型銀屑病是銀屑病中最常見類型，約占銀屑病的90%以上[9]，由于該病病因及機制尚未完全清楚，已成為臨床研究重點。近年來，內源性大麻素系統在疾病發生及治療中的作用越來越受到重視，研究發現[10]，內源性大麻素系統在應激、疼痛、免疫、認知、運動、腫瘤等多種腫瘤生理過程中發揮重要作用。同時，在維持皮膚穩態及調控細胞增殖、分化、凋亡中起重要作用[11]。CNR作為內源性大麻素系統中關鍵性組成部分，在其功能發揮中發揮核心作用[12]，包括CNR1和CNR2兩種主要的類型，CNR1主要存在于中樞神經系統，近年來發現，脾臟、皮膚、免疫細胞等外周器官及組織中也分布廣泛[13]，CNR2主要分布在脾臟、扁桃體等外周器官，在免疫調節中發揮重要作用[14]。陶科明等[15]指出，CNR1和CNR2在潰瘍性結腸炎中表達上調，可能參與了其發生發展過程。本研究為進一步探討CNR在尋常型銀屑病發生中的作用，對患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達進行了分析。

本研究結果顯示，尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清對照組，且皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均高于皮膚對照組，說明CNR1和CNR2在尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中表達水平升高，提示CNR1和CNR2可能參與了尋常型銀屑病發病過程。本研究結果顯示，與血清對照組和皮膚對照組相比，進展期和靜止期尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達水平均升高，且進展期高于靜止期，說明CNR1和CNR2可能與尋常型銀屑病患者病情嚴重程度有關，隨著尋常型銀屑病病情活躍程度增加，CNR1和CNR2表達量增加，提示CNR1和CNR2有望成為監測患者病情的指標。同時，本研究相關分析亦顯示，患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2水平均與PASI評分呈正相關，而PASI是反映銀屑病嚴重程度的指標[16]，進一步說明CNR1和CNR2可能參與了患者病情進展過程。

綜上所述，尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達升高，且與患者病情嚴重程度有關，可能參與了患者病情進展過程，有望為尋常型銀屑病機制研究及臨床治療提供新的方向和靶位。

作者簡介：安金剛(1978-)，男，山東人，博士，副研究員，主要研究方向為特應性皮炎，銀屑病。