血小板相關抗體及膜糖蛋白在胃癌患者中的臨床檢測意義探析

何曉鳳,李 秋

(1.四川大學華西醫院 腹部腫瘤科,四川 成都610041；2.成都市龍泉驛區第一人民醫院·四川大學華西醫院龍泉醫院)

胃癌目前發病率占全球的第五位,死亡率占全球第三位[1]；而我國的胃癌患者總數高達全球的40%[2],其發病率和死亡率均高居我國腫瘤的第二位[3],嚴重威脅人們的身體健康及生活質量。據報道,惡性腫瘤患者的預后與其體內血小板變化關系密切,腫瘤的侵襲及轉移是患者致死的重要原因[4],而血小板可能促進腫瘤轉移形成,且在腫瘤細胞血行轉移中可能扮演了重要角色,表現為活化后的血小板聚集并黏附在腫瘤細胞上,幫助腫瘤細胞逃逸免疫系統的監控,從而促進其血行轉移[5]。血小板是否活化可以通過檢測血小板膜糖蛋白(PMG)的水平得知,CD62P、CD63是近年發現的黏附分子家族中的成員,定位于血小板的α顆粒和內皮細胞棒管狀(Weible-Palade)小體內,能介導血小板及血管內皮細胞和腫瘤細胞的黏附,促進腫瘤轉移[6]。研究表明,血小板相關抗體(PAIgG)是免疫性血小板減少癥患者的一個重要實驗室輔助診斷指標,其與PMG結合可成為重要靶抗原之一[7-10]。本研究旨在通過檢測胃癌患者的PMG CD62p、CD63及PAIgG的表達水平,探析上述指標在胃癌患者診治中的價值。

1 對象與方法

1.1研究對象

選擇2016年2月至2017年1月在四川大學華西醫院龍泉醫院接受治療的胃癌患者。入選標準：(1)經病理確診為胃癌(腺癌或印戒細胞癌)；(2)年齡20-70歲；(3)臨床資料完整；(4)接受根治性手術切除或至少一次靜脈化療治療。排除標準：(1)合并糖尿病者；(2)入院治療前一個月曾接受抗凝治療及抗血小板藥物治療者。最后,共120例患者入組,根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)2010年第7版TNM分期標準,其中ⅠA-ⅡB期患者48例(早中期),ⅢA-Ⅳ期患者72例(中晚期)。另外選取同期在我院接受健康體檢的120例體檢健康者作為本次研究的對照組。胃癌組患者入院確診后于術前/化療前一周采空腹肘靜脈血，并于術后/化療后3周采血復檢；對照組采用體檢凍存血樣檢測。其中胃癌患者接受的化療方案包括：單藥替吉奧、單藥卡培他濱、SOX方案(替吉奧+奧沙利鉑)、XELOX方案(卡培他濱+奧沙利鉑)。

1.2方法

保存血樣：-70度冰箱保存的血樣，均為清晨空腹抽取肘靜脈血，置于EDTA抗凝管內，充分混勻凍存，室溫融化后檢測。

主要試劑及儀器：ImmunoTech公司生產的CD62p-PE、CD63-PE、CD61-FITC及CD41與同型對照IgG1-PE、FITC2羊抗人IgG單克隆抗體等；美國貝克曼庫爾特公司生產的EPICS-XL流式細胞儀,浙江省白洋離心機廠生產的BFX52320型醫用低速離心機等。

PMG標記檢測：在3支測定管內各加入CD61-FITC液體,后分別注入CD62p-PE(試管A)、CD63-PE(試管B)、IgG1-PE(試管C),經PBS稀釋后各自注入全血,避光室溫下靜置,上機檢測。將試管C作為陰性對照并適度調整電壓,標記CD62p-PE、CD63-PE；計算CD61門中CD62p、CD63陽性率。

血小板的樣本制備及相關抗體的標記：充分混勻靜脈抗凝血,離心處理后提取富血小板血漿,注入洗滌液TEN混勻,反復洗滌后離心處理,去除上清液,沉淀物經PBS稀釋后制成血小板混懸液。在測定管中注入FITC2羊抗人IgG單克隆抗體,對照管內加入IgG1,將混懸液分別加入測定管及對照管內,避光室溫下孵育,PBS液洗滌并稀釋后上機檢測。

1.3統計學方法

2 結果

2.1一般資料

如表1所示,胃癌組與對照組兩組患者的性別、年齡、BMI及空腹血糖等一般資料無明顯統計學差異(P>0.05)。

表1 兩組患者的一般資料比較

2.2兩組患者的PAIgG及PMG水平

表2結果可見,胃癌組患者的PAIgG、CD62p及CD63水平明顯高于對照組(P<0.01)。

表2 兩組患者的PAIgG及PMGCD62p及CD63水平比較

2.3胃癌患者治療前后的PAIgG、PMG水平

表3結果可見,胃癌患者治療后的PAIgG、CD62p及CD63水平明顯低于治療前(P<0.05)。

表3 胃癌患者治療前后的PAIgG、PMGCD62p及CD63水平比較

3 討論

惡性腫瘤的發生發展是一個極其復雜的過程,血小板數量往往會隨之上升或其活性會隨之增強。血小板在正常血液循環系統中呈靜息狀,但在與腫瘤細胞相互作用及血管內皮受損等過程中會釋放大量活性物質,從而激活并釋放了血小板[11,12]。據報道,大部分惡性腫瘤者的凝血系統會異常,如血小板數量及凝血酶抗凝血酶復合物等顯著增加等,而凝血酶水平的突然增加會致使血小板大量聚集并粘附于腫瘤細胞及血管內皮細胞上,增進了癌細胞血行轉移能力[13]。隨著我國人民生活水平的提高、生活節奏的加快及生活習慣的變化,胃癌的發病率逐年遞增。如何有效監測胃癌患者治療療效及評估病情變化及預后分析是目前臨床上被廣泛關注的問題。

CD62p是選擇素家族的一員,儲存在血小板α顆粒及中等以上大血管內皮細胞的Weiber-Palade小體內。如果血小板被活化,CD62p會伴隨部分顆粒內容被大量釋放或者經開放管道系統膜融合血小板膜而在活化血小板表面持久表達,該表達不會隨著時間的延長而消失,也不會被漿蛋白掩蓋[14]。據報道,CD62p是迄今為止特異性較好的可標記血小板活化及釋放的分子之一[15]。CD63屬于溶酶體膜蛋白,如果血小板活化,溶酶體膜則溶解,融合血小板漿膜后在血小板膜上表達,是血小板活化的重要標志之一[16]。PAIgG與血小板壽命及計數呈顯著負相關性,治療后患者血小板計數雖然在正常范圍內,但抗體水平仍不斷增加[17]。

本研究結果顯示,胃癌組患者的PAIgG、CD62p及CD63水平明顯高于對照組,提示胃癌者的外周血血小板呈活化狀,而活化狀血小板可以通過多種方式影響腫瘤細胞,如覆蓋腫瘤細胞,致使免疫系統不能完全清除或識別腫瘤細胞；提高腫瘤粘附內皮細胞培養基及血管內皮細胞的能力,有助于腫瘤細胞血行轉移的進行[18]。此外,胃癌患者治療后的PAIgG、CD62p及CD63水平明顯低于治療前(P<0.05),提示有效治療可降低血小板相關抗體及其膜糖蛋白的表達水平,有助于臨床醫師監測胃癌患者治療的療效,評估預后。