酵母菌發酵藍莓酵素的工藝優化

劉 鑫 ，朱 丹 ，牛廣財 *，魏文毅 ，張 琪 ，樊秋元

（1.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319）

藍莓果實中含有碳水化合物、纖維素、半纖維素、脂肪及蛋白質等營養成分，鈣、鐵、鋅和維生素等微量營養素，以及多種功能因子，具有抗氧化、改善視力、預防心血管疾病、保肝等功效。藍莓酵素含有豐富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，以及酚類、維生素、黃酮類等次生謝產物，具有抗炎抑菌、凈化血液、抗衰老、增強免疫力等作用。為此以藍莓為原料，采用酵母菌作為發酵菌種，制備一種蛋白酶活力與SOD酶活力較高的功能性酵素產品，為生產實踐提供數據依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓：黑龍江省大慶市農貿市場；葡萄酒專用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售；Pectinex XXL果膠酶 （酶活 14 000 U）：Novozyme諾維信公司；福林酚試劑：國藥集團化學試劑有限公司；SOD酶活力檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

手持式折光儀：河北潤聯科技開發有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；EX324電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡離心機：金壇市城西春蘭試驗儀器廠；UV-1100紫外-可見分光光度計：上海凌析達儀器；DRP-9082電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 工藝流程與操作要點

藍莓→清洗、破碎→酶解→調糖→滅菌→冷卻→接種→發酵→酵素產品。

1.3.1 酶解 藍莓清洗破碎之后經Pectinex XXL果膠酶酶解，果膠酶添加量為2.4 mL/kg，于50℃酶解2 h。

1.3.2 調糖 在室溫條件下，將白砂糖直接加入到藍莓果汁中，通過手持糖度儀測定糖度，將其糖度調整至18%。

1.3.3 滅菌 采用巴氏殺菌方式對藍莓果汁進行滅菌，85℃滅菌15 min后冷卻至室溫。

1.3.4 菌種的活化 高活性干酵母用10倍蒸餾水溶解，于35℃恒溫水浴鍋中活化30 min，備用。

1.4 酵母菌發酵單因素試驗

1.4.1 發酵時間的確定 調整藍莓果汁發酵初始糖度為18%，酵母菌接種量 0.2%，發酵初始 pH 4.0，滅菌后置于 25 ℃發酵，發酵時間設定為 1，2，3，4 d，測定蛋白酶活力和SOD酶活力，確定最佳發酵時間。

1.4.2 發酵溫度的確定 調整藍莓果汁發酵初始糖度為18%，發酵初始 pH 4.0，酵母菌接種量 0.2%，滅菌后發酵液分別在19，22，25，28℃條件下發酵2 d，測定蛋白酶活力和SOD酶活力，確定最佳發酵溫度。

1.4.3 初始pH的確定 調整藍莓果汁發酵初始糖度為18%，酵母菌接種量0.2%，設置發酵初始pH分別為3.6、3.8、4.0、4.2，滅菌后在 25 ℃條件下發酵 2 d，測定蛋白酶和SOD酶活力，確定最佳發酵初始pH。

1.4.4 接種量的確定 調整藍莓果汁發酵初始糖度為18%，發酵初始pH 4.0，設置酵母菌接種量分別為0.10%，0.15%，0.20%，、0.25%，0.30%，滅菌后在 25 ℃條件下發酵2 d，測定蛋白酶和SOD酶活力，確定酵母菌最佳接種量。

1.4.5 正交試驗 依據單因素試驗結果，以發酵時間、發酵溫度、發酵液初始pH和接種量4個因素進行L9（34）正交試驗，確定酵母菌發酵藍莓果汁的最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test factor level

1.5 指標測定

1.5.1 蛋白酶活力 藍莓酵素蛋白酶活力測定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》。

1.5.2 SOD酶活力 藍莓發酵液離心，取上清液，根據SOD酶試劑盒說明書進行酶活力測定。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵單因素試驗

2.1.1 酵母菌發酵時間對藍莓酵素酶活力的影響 發酵時間對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響如圖1所示。

圖1 發酵時間對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 1 Effect of fermentation time on the activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由圖1可知：隨著發酵時間的延長，酶活力逐漸增加，發酵第2 d蛋白酶活力達到最高；發酵第3 d出現蛋白酶活力下降現象，此后趨于穩定狀態。蛋白酶活力下降的原因是，發酵過程中產生有機酸，使發酵體系的pH降低，從而抑制酶活力。

由圖1還可知：隨著發酵的進行，SOD酶活力不斷增加，發酵第3 d酶活力達最大；發酵第4 d出現酶活力下降現象，可能是發酵產生的有機酸抑制了活力。

綜合兩種酶活力的大小，確定酵母菌發酵藍莓酵素的最佳發酵時間為2 d，蛋白酶活力與SOD酶活力分別為 22.92 U /mL 與 28.04 U /g。

2.1.2 酵母菌發酵溫度對藍莓酵素酶活力的影響 發酵溫度對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響見圖2。

圖2 發酵溫度對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 2 Effect of fermentation temperature on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由圖2可知：在19℃時，蛋白酶與SOD酶活力最低，酵母菌發酵的速率最低；隨著發酵溫度的上升，蛋白酶與SOD酶活力明顯上升，在25℃時達到最大值，溫度上升到28℃時，蛋白酶活力稍有下降，而SOD酶活力下降明顯，說明SOD酶活力受溫度的影響較大。綜上所述，酵母菌發酵最適溫度為25℃。

2.1.3 發酵液初始pH對藍莓酵素酶活力的影響 發酵初始pH對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響見圖3。

圖3 發酵初始pH對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 3 Effect of initial pH of fermentation on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由圖3可知：pH為3.6時，蛋白酶及SOD酶的活力較低，可能是酶活力受到抑制；發酵初始pH上升到3.8時，蛋白酶活力及SOD酶活力顯著；提升并達到最高值；發酵初始pH大于3.8，功效酶的活力明顯下降，不利于酵母菌發酵。綜上所述，藍莓酵素的最佳初始 pH 為 3.8。

2.1.4 酵母菌接種量對藍莓酵素酶活力的影響 接種量對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響見圖4。

圖4 接種量對藍莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 4 Effect of inoculation amount on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

如圖4所示：酵母菌接種量由0.10%增加到0.20%時，蛋白酶活力逐漸增加并達到最大值；隨著接種量的增加，發酵液中的氧氣和營養物質消耗過多，不利于發酵，蛋白酶活力呈下降趨勢；當接種量達0.15%時，SOD 酶活力達到最高，為 30.23 U/g。 故最佳酵母菌接種量為0.20%。

2.2 酵母菌發酵藍莓酵素的工藝條件優化

酵母菌發酵藍莓酵素正交試驗設計及結果見表2。

由表2極差分析可知：酵母菌發酵對藍莓酵素蛋白酶活力影響的主次順序為B＞C＞D＞A，發酵時間對蛋白酶活力影響最大，其次為發酵初始pH，發酵溫度與接種量對蛋白酶活力的影響最小；由K值可知，使蛋白酶活力最大化的最優組合為A1B3C1D1，即發酵溫度 22 ℃，發酵時間 3 d，初始 pH 3.6，接種量 0.15%；酵母菌發酵對SOD酶活力影響因素的主次順序為B＞A＞D＞C，發酵時間對SOD酶活力的影響因素最大，其次為發酵溫度，接種量與發酵初始pH對SOD酶活力的影響較小；由K’值可知，使SOD酶活力最大化的最優組合為A3B3C2D2，即發酵溫度28℃，發酵時間3 d，初始 pH 為 3.8，接種量為 0.20%。

表2 酵母菌發酵藍莓酵素正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test design and results of yeast fermentation blueberry enzyme

2.3 最佳工藝條件驗證試驗

最佳工藝條件驗證試驗結果見表3。

由表3可知：組合A1B3C1D1的蛋白酶活力最高為29.85 U/mL，組合 A3B3C2D2SOD的酶力最高為55.93 U/g；兩種發酵條件下蛋白酶活力差異不大，而A3B3C2D2的SOD酶活力明顯高于正交最優組合A1B3C1D1。因此，藍莓酵素最佳的發酵工藝條件為：發酵溫度 28 ℃，初始 pH3.8，接種量 0.20%，發酵時間 3 d。在此條件下，藍莓酵素的蛋白酶活力為29.76 U/mL，SOD 酶活力為 55.93 U/g。

表3 最佳工藝條件驗證試驗Table 3 Verification test for optimaltechnical condition

3 結論

經單因素試驗和經正交試驗優化后，藍莓酵素的最佳工藝條件為：發酵溫度28℃，初始pH為3.8，接種量為0.20%，發酵時間為3 d。在此條件下蛋白酶活力達到 29.76 U/mL，SOD 酶活力達到 55.93 U/g。 說明通過酵母菌發酵，可以制備蛋白酶活力與SOD酶活力較高的藍莓酵素產品。