干擾ABCG2的表達對宮頸癌細胞化療的增敏作用

黃文金 盧翠萍 陳 琴 郭寶玲 鄭俊瓊

(福建醫科大學附屬龍巖市第一醫院腫瘤內科，福建 龍巖 364000)

宮頸癌的發病率和死亡率在女性患者中逐年增高。目前，宮頸癌的治療手段仍以手術切除和化療為主，但是由于耐藥性的多發使得宮頸癌的治療效果不理想，嚴重影響宮頸癌患者的生存年限和生活質量〔1〕。因此，如何有效解決宮頸癌化療藥耐藥是目前最關鍵的問題〔2〕。三磷酸腺苷結合盒轉運體(ABC)G2的高表達是造成多種腫瘤發生多藥耐藥的重要因素之一，宮頸癌細胞中的ABCG2也處于高表達狀態〔3〕。若能夠成功下調ABCG2的表達，可能有效提高宮頸癌細胞對化療藥的敏感性，增強腫瘤的化療效果〔4〕。本研究旨在探索干擾ABCG2的表達對耐藥細胞化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1細胞 普通HeLa細胞與HeLa/MMC細胞株均購于中國醫學科學院研究所。HeLa/MMC細胞系對MMC表現出5.02倍耐藥，對順鉑有交叉耐藥，對5-氟尿嘧啶、長春新堿、 阿霉素敏感。

1.2試劑 絲裂霉素購自協和發酵工業株式會社(日本),RIPA、MTT購Sigma公司(美國)，二甲基亞砜(DMSO)購于北京化工廠(分析純)，總RNA提取試劑盒購、qRT- PCR試劑盒均購于Thermo Fisher Scientific公司(美國)。

1.3方法

1.3.1細胞培養與生長曲線的繪制 普通HeLa細胞培養于RPMI1640培養液(含10 %滅活的胎牛血清和1 %雙抗)中，耐藥細胞HeLa/MMC培養于含MMC的RPMI1640完全培養液中,培養箱環境為37℃、5%CO2、飽和濕度，HeLa/MMC細胞在使用前1 w進行無MMC培養。生長曲線繪制方法：取生長狀態良好的細胞，傳代、消化后制成細胞懸液；細胞計數后將相同數量的細胞分別接種于24孔培養板的各孔內，每隔1 d消化3孔細胞進行計數并計算平均值，隔天更換培養液；以時間為橫軸，細胞數的對數為縱軸，描繪該細胞的生長曲線。后續研究均取對數期細胞進行實驗。

1.3.2重組慢病毒Ad-ABCG2-siRNA的構建 根據shRNA設計方法設計靶向ABCG2 基因的shDNA序列,經公司篩選并進行合成。目標shDNA的兩端含限制性核酸內切酶酶切位點的粘末端，可與雙酶切后的質粒載體pGPU6/GFP/Neo結合。然后將重組的質粒轉化至大腸桿菌DH5α感受態細菌內，培養后挑選單克隆進行PCR鑒定，選取陽性結果的菌群測序送檢。序列對比無誤后將重組質粒和穿梭質粒用Lipofectamine2000轉染至293T細胞內，轉染過程使用無血清培養基，6 h后更換完全培養基(含 6%胎牛血清)。培養72 h后收集培養液上清，制成病毒懸液備用。

1.3.3穩定表達細胞系的建立 將HeLa/MMC細胞接種于24孔板，每孔細胞數為5.2×104個，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。24 h 后實驗組細胞加入濃縮后的病毒懸液以及輔助轉染的相關試劑(5 μg/ml),陰性對照組加入NC-siRNA病毒懸液，空白對照組不做處理。感染24 h后更換完全培養液，72 h后觀察細胞中的熒光蛋白表達情況。

1.3.4ABCG2的表達測定 首先使用qRT-PCR方法測定mRNA的表達水平。總RNA提取參考試劑盒說明書進行，提取后用Nanodrop-2000測定濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定純度。qRT-PCR的反應體系參考逆轉擴增一步法試劑盒說明書，逆轉錄溫度42℃，時間60 min，PCR程序設定為94℃ 2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃ 10 min。紫外成像并使用掃描儀進行半定量分析(以GAPDH基因為內參)；利用Western印跡方法進行蛋白表達水平的測定。提取各組細胞的蛋白，經聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法定量后使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離，然后轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉后加入一抗置于搖床上4℃過夜，沖洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，1 h后顯影。

1.3.5MTT法測定細胞增殖抑制率 取對數生長期的HeLa/MMC細胞和穩定表達的HeLa/MMC細胞系細胞,計數后種于不同的96孔培養板中,每孔2.3× 104個,分別設置空白組、不給藥組以及實驗組，其中7個實驗組MMC的給藥濃度如下：0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L，不給藥組加入相應量的培養液。 37℃、5%CO2培養72 h后用MTT處理。每孔加MTT 溶液(5 mg/ml)100 μl，培養4 h后，每孔加DMSO 100 μl，充分振蕩后用酶標儀測定OD570。計算各組細胞抑制率=1-(實驗組OD570-空白組OD570)/(對照組OD570-空白組OD570)× 100%。做量效曲線并進行直線回歸,求半數有效劑量IC50，化療敏感性提高倍數=HeLa/MMC細胞IC50/穩定表達的HeLa/MMC細胞IC50-1。

1.3.6流式細胞術測定細胞的凋亡 取對數生長期的HeLa/MMC細胞及穩定表達的HeLa/MMC細胞系細胞,計數后種于6孔培養板中,培養過夜給藥，MMC的終濃度為0.4 mg/L，在給藥48 h后進行細胞收集,洗滌后加入PI混勻,室溫避光孵育30 min后及時上機檢測。

1.4統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1ABCG2的表達測定 qRT-PCR結果顯示，內參的RNA條帶灰度值基本一致，而ABCG2 mRNA的表達存在組間差異，其中HeLa/MMC細胞組的ABCG2-mRNA表達量(0.975 4)最高，其次是普通的HeLa細胞組(0.784 2)，而被轉染后穩定表達的HeLa/MMC細胞組的ABCG mRNA表達量最低(0.378 6)。此結果說明被轉染后的HeLa/MMC細胞中的ABCG2在mRNA水平上被成功下調。

Western印跡結果顯示，內參的表達基本一致，而ABCG2蛋白的表達存在組間差異，其中HeLa/MMC細胞組的ABCG2蛋白表達量最高(0.954 3)，其次是普通的HeLa細胞組(0.784 2)，而被轉染后穩定表達的HeLa/MMC細胞組的ABCG2蛋白表達量最低(0.457 6)。此結果說明，被轉染后的HeLa/MMC細胞中的ABCG2蛋白表達被成功下調，此結果與上述qRT-PCR結果相吻合。

2.2細胞增殖抑制率 經不同濃度的絲裂霉素處理后，ABCG2表達下調的HeLa/MMC細胞組(實驗組)的細胞抑制率明顯高于未經干擾的HeLa/MMC細胞組(對照組)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。說明干擾ABCG2表達可以增強絲裂霉素對HeLa/MMC細胞增殖的抑制作用。

表1 各組細胞在不同濃度的MMC作用下的抑制率

與HeLa/MMC細胞組比較：1)P<0.05

圖1 抑制率-藥物濃度曲線(量效曲線)

根據量效曲線做直線回歸計算IC50值。穩定表達組細胞的IC50值明顯減小(0.093)，HeLa/MMC細胞組為0.411。根據增敏倍數公式計算出HeLa/MMC細胞對MCC的敏感性提高3.42倍。進一步證實下調ABCG2表達可以有效增強HeLa細胞的化療敏感性。

2.3細胞凋亡 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，ABCG2表達被干擾后，耐藥細胞HeLa/MMC細胞的凋亡率明顯增加，48 h凋亡率為(35.6±1.1)%，而未經重組慢病毒Ad-ABCG2-siRNA轉染的耐藥細胞株HeLa/MMC的凋亡率為(15.3±2.3)%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。因此，下調ABCG2蛋白的表達可促進腫瘤細胞HeLa/MMC的凋亡，即增強絲裂霉素對HeLa細胞的促凋亡作用。這是下調ABCG2蛋白可增強HeLa/MMC細胞對絲裂霉素的化療敏感性的機制之一。

3 討 論

隨著基因組學和蛋白組學的發展，腫瘤治療的研究也隨之有所深入，其中腫瘤的發生發展機制以及腫瘤耐藥機制的研究引起越來越多的重視〔5〕。宮頸癌是婦科常見腫瘤，發病率逐年增長，同時伴隨發病年輕化趨勢〔6，7〕。目前手術和化療仍是宮頸癌治療的重要手段，而如何有效預防切除術后的復發和化療藥物的耐藥性是克服宮頸癌治療難題的關鍵〔8，9〕。隨著腫瘤的多藥耐藥分子機制的探究，越來越多潛在的逆轉耐藥性靶點被揭示，ABCG2蛋白便是其中之一。ABCG2蛋白是ATP結合盒轉運體G2蛋白，屬于ABC轉運蛋白家族成員，它是一種可以識別、結合并水解ATP的膜轉運蛋白，是細胞抵御外來物質的一種功能蛋白，可利用ATP水解釋放的能量將藥物等外來化合物泵出細胞〔10，11〕。研究發現，許多腫瘤細胞多藥耐藥性的發生都與細胞中的ABCG2蛋白高表達相關〔12〕。因此，抑制或者下調腫瘤細胞中ABCG2蛋白的表達是逆轉耐藥性的重要機制之一。為了實現這一目的，可采取RNA干擾技術實現高效特異穩定地下調目的蛋白表達。其中siRNA是一類可以特異性水解靶標mRNA的非編碼RNA，在基因沉默過程中發揮重要作用〔13，14〕。

綜上所述，下調ABCG2的表達對宮頸癌細胞具有化療增敏作用，其機制與下調ABCG2蛋白的表達可促進耐藥細胞HeLa/MMC的凋亡有關。