養心氏片對心力衰竭大鼠心肌凋亡的影響

郭志剛 于春霞 宋新旗

(黃河科技學院，河南 鄭州 450063)

研究表明，心肌細胞凋亡是導致心力衰竭發生與發展的重要病理基礎，心力衰竭的心肌細胞與神經內分泌系統的活動密切相關〔1，2〕。連接蛋白(Cx)43是構成心肌細胞間縫連接通道，在心肌細胞膜上Cx43存去磷酸化和磷酸化兩種狀態，有效調控細胞間縫連接〔3〕。有研究顯示，在心力衰竭患者心肌細胞中Cx43磷酸化(P-Cx43)水平異常升高，關閉細胞間縫連接，增強Cx43降解，進而影響細胞間信號轉導〔4〕。養心氏片由人參、黃芪、靈芝、淫羊藿、當歸、山楂、丹參、延胡索、地黃、葛根、灸甘草、黃連組成，有化瘀止痛、益氣活血的功效，其組方強調以通為養、以補為養、以安為養，是重要的中成藥制劑〔5,6〕。本研究分析養心氏片對心力衰竭大鼠心肌凋亡的影響及其機制。

1 資料與方法

1.1藥物 鹽酸阿霉素(RD7121，德國Ruibio)，使用生理鹽水溶解，劑量為2 mg/kg。地高辛片(H31020678，上海信誼藥業)，用生理鹽水溶解，劑量為0.02 mg/kg。養心氏片(080501，青島國風藥業)，用蒸餾水配制，劑量為37.5 mg/kg。

1.2試劑與儀器 本研究中使用倒置熒光顯微鏡系統(奧林巴斯)、Medlab-U/8c生物信號采集分析系統(美易)、DYY-7C型電泳儀(六一儀器廠)、Model-680型酶標儀(BIO-BAD)、微量臺式離心機(BECKMAN)、紫外可見分光光度計(UV-3200PCS)、Masson三色染色液(Leagene)、腦鈉肽(BNP)酶聯免疫試劑盒(博美生物)、Rabbit-Anti-GAPDH(博美生物)、山羊抗兔抗體(H+L)(博美生物)、白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(博美生物)、肌鈣蛋白(cTn)I酶聯免疫試劑盒(博美生物)、TUNEL細胞凋亡試劑盒(碧云天)，其余試劑均為分析純。

1.3動物及分組 SD大鼠購自南京青龍山實驗動物中心，體質量(200±20)g，大鼠均適應性喂養1 w。將所有大鼠隨機分為正常對照組(空白組)、模型組、養心氏片組、地高辛組，每組6只。模型組每周相同時間點注射一次阿霉素，濃度為2 mg/kg，持續干預6 w。養心氏片組、地高辛組均采用模型組方式進行造模，造模3 w后每日相同時間點給藥。養心氏片組大鼠灌胃給藥，給藥濃度37.5 mg/kg，地高辛組大鼠灌胃給藥，給藥濃度0.02 mg/kg。其余組灌胃等體積生理鹽水。

1.4樣本制備及心功能檢測 本組研究中，利用生物信號系統在6 w后檢測大鼠心率(HR)、左室舒張期末壓(LVEDP)、左室峰壓(LVSP)、左室內壓變化速率(dp/dtmax)，檢測時穩定15 min，并記錄0.5 h。再記錄完成后，頸總動脈取血，3 000 r/min離心10 min，后-80℃分裝保存，用于檢測生化指標。取大鼠心臟并稱重，計算大鼠心重/體重(HW/BW)比值，暴露心室心底部及心尖部，其中心底部使用多聚甲醛固定，用Masson染色觀察膠原纖維增生及形態學情況，使用Western印跡檢測心尖部P-Cx43及β-actin水平，所有過程嚴格遵照試劑盒說明書進行操作。

1.5心肌細胞凋亡檢測 利用TUNEL檢測試劑盒檢測大鼠心肌組織凋亡細胞。光學顯微鏡下凋亡細胞細胞核呈黃色(陽性)，正常細胞呈藍色(陰性)。每只大鼠隨機選取4張切片，400倍光學顯微鏡下每張切片觀察5個視野，計算凋亡細胞占比，取其均值作為心肌細胞凋亡指數(AI)。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件，采用單因素方差分析多組數據，使用S-N-K法行兩兩比較，Pearson法單因素直線回歸分析變量間相關性，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠血流動力學變化 模型組LVEDP水平顯著高于空白組(P<0.05)，HR、LVSP、dp/dtmax水平明顯低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，地高辛組及養心氏片組大鼠LVEDP水平均顯著低于模型組(P<0.05)，HR、LVSP、dp/dtmax水平明顯高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，養心氏片組大鼠LVEDP水平顯著低于地高辛組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學結果

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與地高辛組比較：3)P<0.05，下表同

2.2大鼠血中炎癥因子及HW/BW水平 模型組BNP、cTnI、IL-6、TNF-α、HW/BW均顯著高于空白組(P<0.05)，地高辛組及養心氏片組BNP、cTnⅠ、IL-6、TNF-α、HW/BW均顯著低于模型組(P<0.05)，養心氏片組大鼠BNP水平顯著高于地高辛組(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠血中炎癥因子及HW/BW水平檢測結果

2.3心肌膠原纖維檢測結果 模型組大鼠心肌細胞膠原容積分數及AI顯著高于空白組(P<0.05)，地高辛組及養心氏片組大鼠心肌細胞膠原容積分數及AI顯著低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 心肌膠原纖維及心肌細胞凋亡結果

2.4左心室P-Cx43表達 模型組大鼠P-Cx43/β-actin水平顯著高于空白組(P<0.05)，地高辛組及養心氏片組大鼠P-Cx43/β-actin水平明顯低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.5心肌細胞凋亡程度與P-Cx43水平的相關性 Pearson線性分析結果顯示，P-Cx43/β-actin水平與大鼠心肌細胞凋亡呈顯著正相關關系(P<0.05)。見圖2。

圖1 P-Cx43水平檢測結果

圖2 心肌細胞凋亡程度與P-Cx43水平相關性

3 討 論

心力衰竭的臨床發病機制復雜，神經內分泌系統、心室重構、體液因子等均與心力衰竭的發生與發展密切相關〔7〕。BNP是體內重要的肽類激素，左心室心肌細胞是BNP合成與分泌的主要細胞〔8〕。有研究指出，當心功能異常出現衰竭后，BNP在血漿中的水平異常升高〔9〕。cTn在骨骼肌及心肌中廣泛存在，其包含三種亞型，具有不同的蛋白結構并由不同基因編碼，cTnI亞型屬于是心肌細胞特有，具有高度特異性，可作為評估心肌損傷的高特異性、高靈敏度的心肌損傷標志〔10〕。有研究指出，TNF-α在心力衰竭的發生與發展過程中起到十分重要的作用，可作為預測心力衰竭的獨立因子〔11〕。在心力衰竭過程中，TNF-α可能參與血管擴張、心肌抑制、心肌纖維化及左室重構等諸多病理過程中。有研究顯示，在心力衰竭患者血中IL-6表達水平顯著增加，且心力衰竭嚴重程度與IL-6表達水平密切相關〔12〕。

程序性細胞死亡又稱為細胞凋亡，指在基因嚴格調控下的細胞主動性死亡過程〔13〕。雖然半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族史調控細胞凋亡的重要蛋白，而有學者指出在心肌細胞凋亡過程中，P-Cx的異常升高與之密切相關，P-Cx在心肌細胞間的化學信息交流及電耦聯過程中起到十分重要的作用〔14〕。在心力衰竭的發生與發展過程中，心肌細胞的凋亡起到十分重要的作用。在評價心功能指標中，dp/dtmax及LVSP是重要的指標，可有效評估心肌收縮功能，其值與心肌收縮功能呈正相關關系，LVEDP是有效評估心室泵血的前負荷的重要指標，心肌舒張功能與LVEDP值呈明顯負相關關系〔15〕。

本組研究表明，心力衰竭大鼠LVSP、dp/dtmax水平顯著降低，LVEDP水平顯著升高，提示心肌舒張及收縮功能顯著降低。此外，心力衰竭大鼠HW/BW及血漿中cTnⅠ、BNP、IL-6、TNF-α水平均顯著升高。Masson染色結果顯示，心力衰竭大鼠可見明顯的心肌細胞受損，心肌細胞膠原容積分數增高。TUNEL染色結果，心力衰竭大鼠的心肌細胞陽性細胞核明顯增高，左心室心肌組織中P-Cx43水平也呈明顯升高狀態，且心肌細胞凋亡與P-Cx43表達水平呈正相關。與心力衰竭組相比，地高辛組及養心氏片組大鼠心臟LVSP、LVEDP及dp/dtmax水平均顯著改善，且HW/BW及血漿中cTnI、BNP、IL-6、TNF-α水平也得以明顯改善。深入分析左心室心肌組織P-Cx43的表達情況，結果顯示左心室心肌P-Cx43的表達也顯著降低，其結果與心肌細胞凋亡結果一致。

綜上所述，養心氏片對可通過調控P-Cx43的表達而改善心力衰竭大鼠的心肌凋亡，并提高大鼠心功能，減輕心肌細胞纖維化及心室重構。