蛋白尿為主要表現的腎損傷患者腎小球TRPC6和ILK的表達及作用機制

陳曉玲 彭 毅

(石河子大學醫學院第一附屬醫院心內科，新疆 石河子 832000)

腎小球濾過屏障結構和生理功能異常引發的蛋白尿是腎損傷患者的主要臨床特征，而足細胞結構中的裂孔隔膜和足突是腎小球濾過屏障的主要成分〔1〕。足細胞正常結構的破壞是多種原發或繼發腎臟疾病蛋白尿發生與發展的主要因素〔2〕；因此，修復并維持足細胞的正常結構和功能是腎臟疾病治療的關鍵。相關研究顯示，足細胞中瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)6及其介導的上、下游信號通路與蛋白尿相關〔3〕。整合素連接激酶(ILK)是足細胞中肌動蛋白與整合蛋白相互連接的骨架，可能參與調控腎小球濾過屏障功能〔4〕。本實驗觀察以蛋白尿為主要表現的腎損傷患者腎小球中TRPC6、ILK表達和分布情況，并通過體外細胞實驗進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1腎組織收集 收集2016年1月至2017年6月間在石河子大學醫學院第一附屬醫院行腎臟穿刺活檢且24 h尿蛋白>1 g的患者腎組織標本共25例。選取同期因腫瘤、外傷等原因切除的腎組織標本為對照組10例，均無蛋白尿。上述標本均經甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋，3 μm連續切片，分別行蘇木素-伊紅(HE)和免疫組化染色。

1.2主要材料與試劑 人原代腎足細胞購于上海晶抗生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM細胞培養基、重組γ干擾素購于江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司；兔抗人TRPC6多克隆抗體和ILK多克隆抗體購于上海信裕生物科技有限公司；脂質體2000、pcDNA3.1-TRPC6質粒購于上海依赫生物科技有限公司。

1.3免疫組化染色 高溫修復抗原，滅活過氧化物酶，羊血清封閉腎組織標本；滴加1∶500倍稀釋的TRPC6、ILK抗體，4℃孵育過夜，剩余步驟按試劑盒說明進行；磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，試劑盒公司提供陽性對照。光學顯微鏡下觀察細胞質中存在黃褐色顆粒為陽性，依據陽性細胞染色情況進行半定量分析。

1.4人原代腎足細胞培養與轉染 用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基培養人原代腎足細胞。向培養基中滴加10 U/ml的重組γ干擾素，33℃ 5%CO2培養箱中孵育，觀察細胞增殖面積占培養皿表面50%以上時，將細胞放于37℃ 5%CO2培養箱中，使用DMEM完全培養基孵育8～12 d。用10-7mol/L的阿霉素誘導成熟的人原代腎足細胞12、24、36 h。通過脂質體2000將pcDNA3.1-TRPC6質粒、pcDNA3.1分別轉入人原代腎足細胞建立TRPC6過表達組、陰性對照組，以僅加脂質體2000的為空白對照組，轉染48 h后用于后續實驗。

1.5Western印跡檢測TRPC6、ILK蛋白表達 蛋白質提取試劑盒提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度。取80 μg蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉非特異性抗原2 h，滴加兔抗人TRPC6多克隆抗體(1∶500)、兔抗人ILK多克隆抗體(1∶500)，選用兔源性β-actin多克隆抗體(1∶1 000)為內參，4℃孵育過夜；洗膜后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫下反應1 h。電化學發光(ECL)顯色，凝膠成像系統讀取目標條帶灰度值。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1腎組織中TRPC6和ILK表達情況 TRPC6和ILK在正常腎組織和各類慢性腎病的腎小球中均有表達。TRPC6多表達于足細胞中，ILK除足細胞外也在系膜區表達。在膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化癥、狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病的腎小球中TRPC6表達強度均明顯高于正常腎組織(P<0.05)；在高血壓腎損傷組織中，TRPC6表達強度與正常腎組織之間差異無統計學意義(P>0.05)。局灶節段性腎小球硬化癥、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病的腎小球中ILK表達強度均明顯高于正常腎組織(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 正常腎組織和各類型腎臟損傷組織中TRPC6表達(免疫組化染色，×400)

圖2 正常腎組織和各類型腎臟損傷組織中ILK表達(免疫組化染色，×400)

2.2阿霉素損傷人原代腎足細胞后TRPC6、ILK蛋白表達情況 正常對照組TRPC6蛋白相對表達量為0.35±0.08；阿霉素組誘導12、24、36 h，TRPC6蛋白相對表達量分別為0.41±0.09、0.68±0.12、0.79±0.15。正常對照組ILK蛋白相對表達量為0.51±0.09；阿霉素組誘導12、24、36 h，ILK蛋白相對表達量分別為0.65±0.13、0.79±0.16、1.16±0.23。10-7mol/L的阿霉素誘導24、36 h時TRPC6、ILK蛋白表達水平均明顯高于正常對照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 阿霉素損傷足細胞后TRPC6、ILK蛋白表達(Western印跡)

2.3人原代腎足細胞過表達TRPC6后對ILK蛋白表達的影響 轉染48 h后TRPC6過表達組人原代腎足細胞TRPC6蛋白相對表達量為0.71±0.25，明顯高于陰性對照組和空白對照組的0.45±0.13、0.38±0.09(P<0.05)；TRPC6過表達組ILK蛋白相對表達量為0.85±0.17，明顯高于陰性對照組和空白對照組的0.60±0.11、0.55±0.13(P<0.05)；陰性對照組和空白對照組TRPC6、ILK蛋白相對表達量之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 足細胞過表達TRPC6后ILK的蛋白表達(Western印跡)

3 討 論

TRPC6屬于瞬時受體電位超家族成員，參與調控足細胞傳導通路以及維持細胞結構。當其發生突變后可引發腎病綜合征、蛋白尿，病理提示為局灶節段性腎小球硬化性改變。相關研究顯示，在膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化癥、微小病變性腎病等腎小球疾病中均可檢測出TRPC6表達上調，且上述疾病臨床癥狀均以蛋白尿為主〔5〕。研究已發現TRPC6可損傷足細胞，進而在蛋白尿和腎小球病變中發揮重要作用〔6〕。正常狀態下足細胞TRPC6的活性很低，經轉染修飾或物理增壓后可明顯提升其活性。本實驗結果顯示，除高血壓腎損傷外，其他類型腎損傷組織(膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化癥等)腎小球中TRPC6表達水平較正常腎組織明顯提升，且在光學顯微鏡下表現為足突不同程度融合，提示TRPC6異常表達與足細胞損傷引發的蛋白尿有關。

ILK為絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過多種信號傳導通路參與細胞增殖、遷移等過程。當其表達上調后可引發足細胞突變，引發蛋白尿。在腎小球疾病、糖尿病腎病等多種蛋白尿性腎病動物模型中均存在ILK異常表達，抑制ILK表達可有效改善蛋白尿癥狀。使用基因敲除技術處理ILK基因后，小鼠足細胞生理功能和結構完整性被破壞〔7〕。上述研究提示ILK可參與腎小球屏障功能調控，但目前ILK表達很少在腎組織活檢中被提及。本實驗顯示，TRPC6、ILK在腎小球中表達部位均位于足細胞，在局灶節段性腎小球硬化癥和糖尿病腎病這兩種發病率較高的足細胞腎病中，ILK表達水平與TRPC6呈正相關，提示TRPC6、ILK可能共同參與足細胞腎病的發生、發展，但二者之間的關聯仍不明確。